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    pBIN438—CMV△Rep表達(dá)載體的構(gòu)建及其在根癌農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化

    2015-07-02 01:32:48雷霄飛楊學(xué)領(lǐng)
    安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2015年8期

    雷霄飛+楊學(xué)領(lǐng)

    摘 要:用PCR方法擴(kuò)增黃瓜花葉病毒部分復(fù)制酶基因(CMV△Rep),連接到PUCm-T載體上構(gòu)建成克隆載體PUCm-T-CMV△Rep。用BamHⅠ和SalⅠ分別對(duì)克隆載體PUCm-T-CMV△Rep和植物表達(dá)載體pBIN438進(jìn)行雙酶切,獲得目的片段和線性質(zhì)粒。在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行定向連接,構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBIN438- CMV△Rep。采用CaCl2凍融法將重組子導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,表明重組質(zhì)粒pBIN438- CMV△Rep已成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中。

    關(guān)鍵詞:復(fù)制酶基因;載體構(gòu)建; 農(nóng)桿菌; 黃瓜花葉病毒

    中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2015)08-13-02

    PBIN438-CMV△Rep Expression Vector and its Transformation in Agrobacterium Tumefaciens

    Lei Xiaofei et al.

    (Department of science and technology, Wuhan Bioengineering Institute,Wuhan 430415,China)

    Abstract:Cucumber mosaic virus partial replicase gene were amplified by PCR (CMV Rep),connected to the PUCm-T vector to construct the cloning vector of PUCm-T-CMV Rep. With BamH I and Sal I of PUCm-T-CMV cloning vector Rep and the plant expression vector pBIN438 were digested, obtained fragment and linear plasmid. Directional connection in T4 DNA ligase, a plant expression vector was constructed by pBIN438-CMV Rep. Using CaCl2 freeze-thaw method the recombinant plasmid into Agrobacterium LBA4404. By PCR and double enzyme digestion showed that the recombinant plasmid, pBIN438- CMV Rep has been successfully introduced into Agrobacterium tumefaciens.

    Key words:Replicase gene; Vector construction; Agrobacterium tumefaciens;Cucumber mosaic virus

    黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是一種寄主范圍非常廣泛的病毒,可以侵染多種經(jīng)濟(jì)類作物,導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。利用基因工程技術(shù)將病毒本身的一部分基因轉(zhuǎn)化至植物基因組中獲得具有抗病性的植株是當(dāng)前病毒病防治的主要途徑[1-2]。

    本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲黃瓜花葉病毒CMV△Rep基因片段,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含有該序列的植物表達(dá)載體pBIN438-CMV△Rep,為利用基因沉默技術(shù)進(jìn)行植物廣譜抗病研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 大腸桿菌DH5a,根癌農(nóng)桿菌LBA4404和質(zhì)粒pBIN438;PUCm-T載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SmaⅠ等均購(gòu)自Fermentas公司。

    1.2 方法

    1.2.1 含CMV△Rep基因質(zhì)粒DNA的制備 挑取含有載體pCAMBIA1302-CMV△Rep的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜培養(yǎng),根據(jù)堿裂解法提取質(zhì)粒,用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 帶特定酶切位點(diǎn)的CMV△Rep基因的引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)CMV△Rep基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,引物的合成、測(cè)序分析工作均由大連寶生物公司完成。Rep-F5'-GATAACTAAGTGGTGG-3',Rep-R(SalI)5'-CGGTCGACCCAGACTTCTTGTATTTC-3'。

    1.2.3 PUCm-T-CMV△Rep載體的構(gòu)建及鑒定 回收CMV△Rep基因片段,與PUCm-T載體相連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,涂布于含有Amp的平板上,隨即挑取單菌落,37℃振蕩培養(yǎng),PCR檢測(cè)并測(cè)序[3]。

    1.2.4 pBIN438-CMV△Rep載體的構(gòu)建及鑒定 利用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切PUCm-T-CMV△Rep和pBIN438,PUCm-T-CMV△Rep酶切基因用瓊脂糖凝膠回收,T 4DNA連接酶過夜,再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,在抗Amp的培養(yǎng)基平板上篩選陽(yáng)性克隆菌落,并用PCR擴(kuò)增鑒定,獲得植物表達(dá)載體pBIN438-CMV△Rep[4]。

    1.2.5 重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及CMV△Rep基因檢測(cè) 采用CaCl2凍融法將植物表達(dá)載體pBIN438-CMV△Rep轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,在篩選培養(yǎng)基平板上培養(yǎng),獲得陽(yáng)性菌落,經(jīng)過PCR擴(kuò)增和酶切鑒定后保存[5]。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 CMV△Rep基因片段的PCR擴(kuò)增 以pCAMBIA1302-CMV△Rep為模板,用引物Rep-F和Rep-R 擴(kuò)增CMV△Rep基因后進(jìn)行電泳, 獲得一條約500bp的目的基因,與預(yù)期結(jié)果相符。使用凝膠回收試劑盒回收CMV△Rep基因片段。

    2.2 pBIN438-CMV△Rep載體的構(gòu)建及鑒定 將構(gòu)建好的質(zhì)粒PUCm-T-GFP測(cè)序,通過DNAstar和Oligo6軟件對(duì)比,與GenBank中CMV△Rep基因序列一致。用BamHⅠ和SalⅠ對(duì)重組質(zhì)粒PUCm-T-CMV△Rep進(jìn)行雙酶切,獲得目的基因CMV△Rep,以pBIN438為基本結(jié)構(gòu),通過雙酶切切開,并和CMV△Rep基因鏈接,獲得植物表達(dá)載體pBIN438-CMV△Rep,結(jié)構(gòu)圖見圖1。以pBIN438-CMV△Rep基因?yàn)槟0?,用引物Rep-F和Rep-R擴(kuò)增CMV△Rep基因后進(jìn)行電泳,結(jié)果顯示擴(kuò)增出一條500bp左右的基因片段。

    圖1 pBIN438-CMV△Rep表達(dá)載體結(jié)構(gòu)

    2.3 根癌農(nóng)桿菌LBA4404-pBIN438-CMV△Rep轉(zhuǎn)化及鑒定 重組質(zhì)粒pBIN438-CMV△Rep導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404,平板培養(yǎng),對(duì)陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行PCR檢測(cè),重組的農(nóng)桿菌LBA4404-pBIN438-CMV△Rep可以擴(kuò)增出約500bp的基因片段。通過提取質(zhì)粒,再用BamHⅠ和 SalⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pBIN438-CMV△Rep進(jìn)行雙酶切,通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切后的CMV△Rep基因片段,電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)??梢员磺谐?個(gè)片段,大片段大于2 000bp,小片段為CMV△Rep約為500bp,結(jié)果見圖2。說明載體pBIN438-CMV△Rep已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。

    圖2 質(zhì)粒pBIN438-CMV△Rep的雙酶切鑒定

    3 討論

    植物病毒是造成作物減產(chǎn)的重要原因,傳統(tǒng)的育種抗病、農(nóng)藥、脫毒等方法對(duì)于病毒的治理不僅耗時(shí)而且污染環(huán)境,近年來發(fā)現(xiàn)的基因沉默被證明能很好的抗相關(guān)病毒的侵染。植物抗病毒基因工程廣泛采用基于病毒復(fù)制酶基因的抗病策略,復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗病性具有抗病性強(qiáng)的特點(diǎn),是解決植物病毒病害的有效方法,已經(jīng)在生產(chǎn)實(shí)際中取得較好的效果。本文是在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建含有這種病毒復(fù)制酶的植物表達(dá)載體,擬用于今后進(jìn)一步對(duì)神農(nóng)香菊的遺傳轉(zhuǎn)化,希望通過沉默基因的轉(zhuǎn)化來培育出具有抗黃瓜花葉病毒的轉(zhuǎn)基因植株,從根本上解決危害神農(nóng)香菊的黃瓜花葉病毒病害問題。

    參考文獻(xiàn)

    [1]Ding S W, Anderson B J, Haase H R, et al. New overlapping gene encoded by the cucumbermosaic virus genome[J]. Virology,1994,198:593-601.

    [2]牛顏冰,青玲,周雪平.RNA沉默機(jī)制及其抗病毒應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志,2004,24(2):76-79.

    [3]張響玲,張延龍, 牛立新,等. 岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導(dǎo)的LrPR10的克隆及表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(6):1218-1226.

    [4]尤佳,張寧,文義凱,等.Gry ⅢA基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2014,23(1):248-256.

    [5]尚愛芹,田傳衛(wèi),趙梁軍,等.Z根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)北海道黃楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(3):409-414.

    (責(zé)編:張長(zhǎng)青)

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