無花果多糖體外抗氧化及抗腫瘤活性研究

郭潤(rùn)妮，倪孟祥

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009）

無花果多糖體外抗氧化及抗腫瘤活性研究

郭潤(rùn)妮，倪孟祥

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009）

從無花果中提取、分離和純化得到了均一性無花果多糖FCPS-1、FCPS-2、FCPS-3，通過測(cè)定DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除率、還原能力研究了其體外抗氧化活性，采用MTT法研究了其體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明：以上無花果多糖均表現(xiàn)出與濃度正相關(guān)的體外抗氧化活性，其中FCPS-3具有相對(duì)更強(qiáng)的體外抗氧化活性。FCPS-3對(duì)HepG-2細(xì)胞和7901細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外抗腫瘤活性，在濃度為2.0mg·mL－1時(shí)，F(xiàn)CPS-3對(duì)HepG-2細(xì)胞和7901細(xì)胞的抑制率分別為57.30%和54.49%。表明無花果多糖可作為潛在的天然抗腫瘤藥物。

無花果多糖；抗氧化活性；抗腫瘤活性

無花果是地中海暖溫帶氣候地區(qū)的一種很常見的?？浦参铮?］。研究表明，食用無花果有助于預(yù)防靜脈阻塞，其高纖維含量還具有通便的作用，而無花果果膠更是可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。從無花果中提取的苯甲醛、呋喃香豆素內(nèi)酯、補(bǔ)骨酯素等多種抗癌活性成分的抗癌效果已得到世界公認(rèn)。此外，無花果中還富含黃酮、多糖、SOD等具有防治心血管疾病和老年癡呆癥的生理活性物質(zhì)［2］，具有極高的研究?jī)r(jià)值。

近年來，多糖因?yàn)榫哂邢鄬?duì)低的毒性和特殊的生物、化學(xué)、物理性質(zhì)而被廣泛研究［3－4］。多糖是無花果中的主要活性成分之一。目前有關(guān)研究無花果多糖的提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定等及提高免疫功能作用已有報(bào)道。但關(guān)于無花果多糖抗氧化和抗腫瘤活性的研究鮮見報(bào)道。因此，作者在分離純化得到均一性無花果多糖的基礎(chǔ)上，對(duì)其體外抗氧化和抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

干無花果，市售，粉碎過40目篩。

二苯代苦味肼自由基（DPPH）、噻唑藍(lán)（MTT）、氯化硝基四唑氮藍(lán)（NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清，Giboco公司；吩嗪硫酸甲酯（PMS）、二甲基亞砜（DMSO）、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

人肝癌細(xì)胞（HepG-2細(xì)胞）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW1116細(xì)胞）、人胃癌細(xì)胞（7901細(xì)胞），中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵、HH-S型水浴鍋、RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；VIS-7220型可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司；BS1245型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限責(zé)任公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科有限公司；直熱式CO2培養(yǎng)箱，Excella公司；倒置相差生物顯微鏡，Olympus公司；血球計(jì)數(shù)器，青島求精計(jì)數(shù)器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 無花果多糖的提取、分離與純化

工藝流程：精密稱取無花果粉末→氯仿抽提去脂→超聲破碎→沸水浸提→過濾、濃縮→Sevage法除蛋白→醇沉→過濾或離心→醇沉物清洗→真空干燥→粗多糖→大孔吸附樹脂脫色→DEAE-52離子交換纖維素柱分離得到單組分→SephadexG-150葡聚糖凝膠過濾層析得到均一組分→冷凍干燥→精多糖。

具體操作：取經(jīng)過氯仿脫脂處理的無花果粉末，加入20BV的水，超聲20min后沸水浸提3h，過濾，濾液濃縮，采用Sevage法除去蛋白，大孔吸附樹脂脫色，醇沉，離心，得到粗多糖FCPS。

取一定量的FCPS溶于雙蒸水，上樣到已平衡的DEAE-52離子交換纖維素柱上，用蒸餾水和不同濃度氯化鈉溶液洗脫，苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)，根據(jù)洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析，干燥，得到3個(gè)無花果多糖純化組分。將得到的3個(gè)組分分別溶解，上樣到已平衡的SephadexG-150葡聚糖凝膠過濾層析柱，采用氯化鈉溶液洗脫，根據(jù)洗脫曲線的主峰位合并收集液，透析脫鹽，冷凍干燥，得到無花果多糖均一組分FCPS-1、FCPS-2和FCPS-3。

1.2.2 無花果多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率測(cè)定［5］

將2.0mL濃度（mg·mL－1）分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5的無花果多糖樣品溶液加入到2mL DPPH溶液（2×10－4mol·L－1，溶解于95%乙醇）中?；旌暇鶆虿⒃诤诎抵蟹磻?yīng)30min，測(cè)定517nm處的吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算：

式中：A0為水代替樣品溶液時(shí)的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為乙醇代替DPPH溶液時(shí)的吸光度。

1.2.2.2 羥基自由基清除率測(cè)定［6］

向1.0mL濃度（mg·mL－1）分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5的無花果多糖樣品溶液中加入1.0mL鄰二氮菲溶液（0.75mmol·L－1，溶解于95%乙醇中）、2.0mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2mmol·L－1，pH值7.4）和1.0mL蒸餾水?；旌暇鶆蚝螅尤?.0mL硫酸亞鐵（0.75mmol·L－1）和1.0mL H2O2（0.01%），37℃反應(yīng)1h，測(cè)定562nm處的吸光度。羥基自由基清除率按式（2）計(jì)算：

式中：A′0為樣品和反應(yīng)溶液的混合物的吸光度；A′1為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.2.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定［7］

向1.5mL濃度（mg·mL－1）分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5的無花果多糖樣品溶液（溶解于Tris-HCl，pH＝8.0，16mmol·L－1）中加入0.5mL NBT溶液（300μmol·L－1，溶解于Tris-HCl，pH＝8.0，16 mmol·L－1）、0.5mL NADH溶液（468μmol·L－1，溶解于Tris-HCl，pH＝8.0，16mmol·L－1），加入0.4mL PMS溶液（60μmol·L－1）啟動(dòng)反應(yīng)，25℃水浴5min，測(cè)定560nm處的吸光度。超氧陰離子自由基清除率按式（3）計(jì)算：

式中：A′′0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；A′′1為樣品溶液的吸光度；A′′2為蒸餾水代替PMS溶液的吸光度。

1.2.2.4 還原能力測(cè)定［8］

向1.0mL濃度（mg·mL－1）分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5的無花果多糖樣品溶液中加入2.5mL PBS（0.2mol·L－1，pH值6.6）和2.5mL鐵氰化鉀（1%），混合均勻，50℃反應(yīng)20min。接著加入2.5 mL三氯乙酸（10%），2 000r·min－1離心10min，吸取上清液2.5mL與0.5mL FeCl3溶液（0.1%）混合，在700nm處測(cè)定吸光度。溶液的吸光度越高，表示還原能力越強(qiáng)。

1.2.3 體外抗腫瘤活性的測(cè)定

選擇HepG-2細(xì)胞、SW1116細(xì)胞、7901細(xì)胞，采用MTT法［9］對(duì)無花果多糖的體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。

將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用胰酶溶液消化，加入培養(yǎng)基，制成細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，待6h細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組（細(xì)胞培養(yǎng)基）、對(duì)照組（細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基）、實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞，多糖培養(yǎng)基，濃度分別為2.0mg·mL－1、1.5mg·mL－1、1.0mg·mL－1、0.5 mg·mL－1），以上各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。之后小心棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h后小心棄去MTT溶液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩器上振蕩10min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定590nm處的吸光度。重復(fù)3次，各組數(shù)據(jù)的平均值用于公式計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 無花果多糖的體外抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基作為一種穩(wěn)定的自由基，可清除其它自由基，清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)［10］。3種無花果多糖對(duì)DPPH自由基的清除率如圖1所示。

由圖1可知，所有樣品對(duì)DPPH自由基的清除率都與濃度呈正相關(guān)。3種樣品對(duì)DPPH自由基清除能力大小依次為：FCPS-2＞FCPS-3＞FCPS-1，在濃度為2.5mg·mL－1時(shí)的清除率分別為54.44%、44.21%和43.30%。

2.1.2 羥基自由基清除率

圖1 無花果多糖的DPPH自由基清除率Fig.1 The scavenging rate of DPPH radicals by polysaccharides fromFicus carica L.

利用Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基可與鄰二氮菲在添加抗氧化劑的條件下反應(yīng)，可得到受試抗氧化劑清除羥基自由基的情況［11］。3種無花果多糖對(duì)羥基自由基的清除率如圖2所示。

圖2 無花果多糖的羥基自由基清除率Fig.2 The scavenging rate of hydroxyl radicals by polysaccharides fromFicus carica L.

由圖2可知，所有樣品對(duì)羥基自由基的清除率都與濃度呈正相關(guān)。3種樣品對(duì)羥基自由基清除能力大小依次為：FCPS-3＞FCPS-2＞FCPS-1，在濃度為2.5 mg·mL－1時(shí)的清除率分別為71.88%、56.25%和46.88%。

2.1.3 超氧陰離子自由基清除率

在檢測(cè)抗氧化物質(zhì)的活性時(shí)經(jīng)常把清除超氧陰離子自由基作為其中一個(gè)重要的指標(biāo)［12］。3種無花果多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如圖3所示。

由圖3可知，所有樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率都與濃度呈正相關(guān)。3種樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除能力大小依次為：FCPS-3＞FCPS-2＞FCPS-1，在濃度為2.5mg·mL－1時(shí)的清除率分別為54.60%、51.53%和44.76%。

2.1.4 還原能力

圖3 無花果多糖的超氧陰離子自由基清除率Fig.3 The scavenging rate of superoxide anion radicals by polysccharides fromFicus carica L.

抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。3種無花果多糖的還原能力如圖4所示。

圖4 無花果多糖的還原能力Fig.4 The reducing capacity of polysaccharidesfromFicus carica L.

由圖4可知，所有樣品的還原能力都與濃度呈正相關(guān)。3種樣品的還原能力大小依次為：FCPS-3＞FCPS-2＞FCPS-1。

2.2 無花果多糖的體外抗腫瘤活性（圖5）

由圖5可知，各個(gè)濃度的FCPS-1、FCPS-2、FCPS-3對(duì)HepG-2細(xì)胞（圖5a）、7901細(xì)胞（圖5b）、SW1116細(xì)胞（圖5c）的增殖均有抑制作用，且隨著多糖濃度的升高抑制率升高，其中濃度為2.0mg·mL－1的FCPS-3對(duì)HepG-2細(xì)胞和7901細(xì)胞的抑制率最高，分別達(dá)57.30%和54.49%，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。對(duì)實(shí)驗(yàn)所選取的3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用在其劑量濃度小于1.0mg·mL－1時(shí)不顯著，當(dāng)其濃度大于1.0mg·mL－1時(shí)，抑制作用開始顯現(xiàn)，但并不呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。

3 結(jié)論

圖5 無花果多糖對(duì)HepG-2細(xì)胞（a）、7901細(xì)胞（b）、SW1116細(xì)胞（c）的抑制率Fig.5 Inhibition rate of polysaccharides fromFicus carica L.aganist HepG-2 cells（a），7901 cells（b），SW1116 cells（c）

從無花果中提取、分離和純化得到了均一性無花果多糖FCPS-1、FCPS-2、FCPS-3。無花果多糖均表現(xiàn)出與濃度正相關(guān)的體外抗氧化活性，其中FCPS-3具有相對(duì)更強(qiáng)的體外抗氧化活性。FCPS-3對(duì)HepG-2細(xì)胞和7901細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外抗腫瘤活性，在濃度為2.0mg·mL－1時(shí)，F(xiàn)CPS-3對(duì)HepG-2細(xì)胞和7901細(xì)胞的抑制率分別為57.30%和54.49%。表明FCPS-3具有最強(qiáng)的生物活性，可為后續(xù)無花果多糖的生物活性研究提供參考。

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Study on Antioxidant and Antitumor Activities of Polysaccharides fromFicus Carica L.in vitro

GUO Run-ni，NI Meng-xiang
（College of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China）

The homogeneous polysaccharides FCPS-1，F(xiàn)CPS-2and FCPS-3were extracted，separated and purified fromFicuscaricaL..Theirinvitroantioxidant activities were studied by scavenging rate determination of DPPH radicals，superoxide anion radicals，hydroxyl radicals and reducing capacity.Theirinvitroantitumor activities were evaluated by MTT assay.Results showed that，three polysaccharides exhibitedinvitroantioxidant activities in a dose-dependent manner.FCPS-3presented relatively stronger antioxidant activity.Among three polysaccharides，F(xiàn)CPS-3showed higherinvitroantitumor activities against HepG-2and 7901cells.At concentration of 2.0mg·mL－1，the inhibition rates of FCPS-3on HepG-2and 7901cells were 57.30%and 54.49%，respectively.These results indicated that polysaccharides fromFicuscaricaL.could be explored as potential natural antitumor agents.

polysaccharides fromFicuscaricaL.；antioxidant activity；antitumor activity

O 629.12

A

1672-5425（2015）03-0049-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.03.012

2014-11-30

郭潤(rùn)妮（1990－），女，安徽人，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：guorunni＠126.com；通訊作者：倪孟祥，副教授，E-mail：nimx2000＠aliyun.com。