土茯苓切面不同顏色總多糖的提取工藝優(yōu)選

杜洪志，農(nóng) 亨，董立莎，何席呈，李家麗，張 靜

（貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽550002）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜（SmilaxglabraRoxb.）的干燥根莖。具除濕，解毒，通利關(guān)節(jié)之功，臨床上廣泛用于濕熱，帶下，疥癬，梅毒及汞中毒等疾病[1]。市售土茯苓切面均為白色[2]，而產(chǎn)于貴州的土茯苓切面卻為紅色，貴州苗族稱之為薄丈達，是具有貴州地域特點的苗族常用大宗傳統(tǒng)藥材，蘊藏量大并有資源優(yōu)勢。由此導致該藥材在應用上的多元化和復雜化。同時，2種不同切面顏色土茯苓在相關(guān)化學成分及藥效上存在著較大差異[3－4]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有增強機體免疫力、抗腫瘤及抗衰老的良好活性，毒副作用較小，故在醫(yī)藥學領(lǐng)域已成為國內(nèi)外專家學者研究的熱點[5－6]。多糖為土茯苓中主要大類成分之一，具有顯著的抗腫瘤及抗氧化活性[7]，但有關(guān)對比研究貴州產(chǎn)（切面紅色）土茯苓與市售品（切面白色）土茯苓中總多糖的最佳提取工藝，迄今未見報道。為比較土茯苓不同切面顏色中總多糖的最佳提取工藝，筆者采用紫外－可見分光光度法及蒽酮－硫酸比色法測定總多糖含量，以期獲得較高含量的土茯苓多糖。同時，對2010年版《中國藥典》總多糖的顯色條件進行優(yōu)化，旨在篩選出簡單高效、穩(wěn)定可行的土茯苓總多糖檢測方法，為土茯苓不同切面顏色篩選關(guān)鍵有效部位的藥效學試驗提供最佳給藥組，也為該藥材資源的合理利用及質(zhì)量控制奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

藥材：切面為紅色的土茯苓于2014年8月采自貴州省貴陽市烏當區(qū)水田鎮(zhèn)，切面為白色的購自北京同仁堂（批號：130102），樣品由貴陽中醫(yī)學院生藥教研室董立莎教授鑒定。

儀器：紫外－可見分光光度計（UV－2501PC 型，日本島津公司），超聲提取器（KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司），萬分之一分析天平（AB104－N型，梅特勒上海有限公司），十萬分之一電子天平（XS205型，瑞士梅特公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX－GF101－Z－S－II，上 海 賀 德 實 驗 設(shè) 備 有 限 公司），恒溫水浴鍋（HH－S4，常州普天儀器制造有限公司）。

試劑：無水葡萄糖對照品（批號：110833－200904，中國藥品生物制品檢定所），蒽酮（批號：20140421，國藥集團化學試劑有限公司），蒸餾水為實驗室自制，其余試劑均為分析純。

1.2 對照品溶液的制備

取無水葡萄糖0.076 9 g，精密稱定，置于25mL的棕色量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得3.076mg／mL葡萄糖對照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總多糖提取樣品的前處理

稱取土茯苓不同切面顏色（二號篩）約50g，加入10倍量95%的乙醇，回流提取3次，每次1h，過濾，殘渣用95%的熱乙醇洗滌數(shù)次后55℃揮盡乙醇，烘干，即得總多糖提取樣品，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 供試品溶液的制備

分別稱取經(jīng)前處理的切面紅色和切面白色樣品約0.5g，精密稱定，按單因素試驗及正交試驗因素水平表提取總多糖，冷卻，補重，搖勻，離心10 min（轉(zhuǎn)速為4 000r／min），取上清液置于50mL的棕色量瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 顯色條件的優(yōu)化

顯色條件的優(yōu)化包括硫酸濃度的考察、蒽酮用量的考察、顯色劑用量比的考察、熱浴時間的考察、熱浴溫度的考察、冷卻時間的考察。

1）硫酸濃度。取同一樣品溶液于10mL 的具塞試管中，精密加入0.15%的蒽酮－硫酸溶液4mL，搖勻，90℃熱浴顯色15min，冰水混合物冷卻15min。硫酸濃度設(shè)為50%、60%、70%、80%、90%和98%，其他顯色因素均為定值，以蒸餾水為空白，在波長為630nm 處測定吸光度（下同）。

2）蒽酮用量。以80%的硫酸溶液作為溶劑，取同一樣品溶液于10mL的具塞試管中，分別精密加入濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%和0.40%的蒽酮－硫酸溶液4mL，搖勻，90℃熱浴顯色15min，冰水混合物冷卻15min。

3）顯色劑用量比。取同一樣品溶液于10 mL的具塞試管中，精密加入不同體積的0.15%的蒽酮－硫酸溶液，使顯色劑與樣品溶液的用量比分別為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20，搖勻，90℃熱浴顯色15 min，冰水混合物冷卻15min。

4）熱浴時間。取同一樣品溶液于10mL 的具塞試管中，精密加入0.15%的蒽酮－硫酸溶液4mL，搖勻，分別于90℃熱浴顯色0min，5 min，10 min，15min，20 min，25 min，30 min，35 min，40 min，45min，50min，55min和60min，冰水混合物冷卻15min。

5）熱浴溫度。取同一樣品溶液于10mL 的具塞試管中，精密加入0.15%的蒽酮－硫酸溶液4mL，搖勻，分別于60℃、70℃、80℃、90℃和95℃熱浴顯色15min，冰水混合物冷卻15min。

6）冷卻時間。取同一樣品溶液于10mL 的具塞試管中，精密加入0.15%的蒽酮－硫酸溶液4mL，搖勻，90℃熱浴顯色15 min，分別于冰水混合物中冷卻0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，35min、40min和45min。

1.6 總多糖含量測定的方法學考察

1.6.1 線性關(guān)系的考察 精密量取對照品溶液0.1mL，0.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0mL，分別置于25mL 的棕色量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，分別取不同濃度的對照品溶液0.5mL于10mL的具塞試管中，精密加入0.15%的蒽酮－硫酸溶液4mL，搖勻，90℃熱浴顯色15min，冰水混合物冷卻15min，以蒸餾水為空白，在最佳波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，含量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.6.2 檢測波長的選擇 取葡萄糖對照品及樣品溶液，按1.6.1項下方法顯色，在200～800nm 進行全波長掃描，記錄試驗結(jié)果。

1.6.3 精密度試驗 精密量取葡萄糖對照品溶液，按1.6.1項下方法連續(xù)測定6 次，記錄試驗結(jié)果。

1.6.4 重復性試驗 取同一批號土茯苓樣品6份，按1.4項方法制備供試品溶液，按1.6.1項下方法進行含量測定，記錄試驗結(jié)果。

1.6.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液，按1.6.1項下方法分別在0 min，40 min，80 min，100min，120min，140min，180min進行吸光度測定，記錄試驗結(jié)果。

1.6.6 加樣回收率試驗 精密稱取土茯苓粉末（二號篩）6份，每份0.25g，根據(jù)樣品減半稱樣后總多糖的含量，加入等量的無水葡萄糖對照品，按1.4項制備供試品溶液，按1.6.1項下方法進行含量測定，計算回收率。

1.7 總多糖提取的不同因素考察

1.7.1 提取方法 在提取時間1 h、料液比1∶20（g／mL）、提取次數(shù)1次的條件下，分別采用回流提取，超聲提取，測定總多糖含量（下同）。

1.7.2 提取溫度 在提取時間1 h、料液比1∶20（g／mL）、提 取 次 數(shù)1 次 的 條 件 下，分 別 在60℃、70℃、80℃、90℃、95℃進行回流提取。

1.7.3 提取時間 在提取溫度90℃、料液比1∶20（g／mL）、提取次數(shù)1 次的條件下，分別回流提取0.5h，1.0h，1.5h，2.0h。

1.7.4 提取次數(shù) 在提取溫度90℃、料液比1∶20（g／mL）、提取時間1h的條件下，分別回流提取1次、2次、3次。

1.7.5 料液比 在提取溫度90℃、提取次數(shù)1次、提取時間1h的條件下，分別采用料液比為1∶10（g／mL）、1∶20（g／mL）、1∶30（g／mL）、1∶40（g／mL）、1∶50（g／mL）進行回流提取。

1.8 總多糖提取的正交試驗

以總多糖為指標，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行正交優(yōu)化試驗，以提取溫度（A），提取時間（B），提取次數(shù)（C），料液比（D）為主要影響因素，設(shè)計L9（34）正交優(yōu)化試驗，每個樣品平行制備3份樣，按照1.6.1項下方法進行總多糖的含量測定。土茯苓不同切面顏色的正交試驗因素水平見表1。

表1 土茯苓切面紅色和白色正交試驗設(shè)計因素水平表Table 1 The levers and factors of the orthogonal test of S.glabra with red and white transverse sections

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

根據(jù)對照品與樣品溶液的紫外吸收光譜，兩者在630nm 處均有最大吸收，故確定最佳的測定波長為630nm。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

1）硫酸濃度為50%、60%、70%、80%、90%和98%的 平 均 吸 光 度 分 別 為0.073 4、0.092 5、0.634 6、0.815 7、0.576 2和0.352 7。硫酸濃度為80%時吸光度值最大。

2）蒽酮用量的百分比為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%和0.40%的平均吸光度分別為0.452 4、0.536 9、0.597 9、0.553 8、0.529 8、0.536 4、0.528 7和0.533 6。蒽酮用量的百分比為0.15%時吸光度值最大。

3）顯色劑用量比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20的平均吸光度分別為0.200 4、0.2356、0.782 5、0.678 2、0.601 3、0.554 2、0.512 9、0.401 2、0.335 7、0.234 5 和0.197 9。顯色劑的用量比為1∶4時吸光度值最大。

4）熱浴溫度為60℃、70℃、80℃、90℃和95℃的平均吸光度分別為0.234 8、0.325 0、0.484 3、0.524 2和0.472 7，熱浴溫度為90℃時吸光度值最大。

5）熱浴時間為0 min、5 min、10 min、15 min、20min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50min、55 min 和60 min 的 平 均 吸 光 度 分 別 為0.216 1、0.314 5、0.343 8、0.461 5、0.345 6、0.330 4、0.305 3、0.278 3、0.262 3、0.261 0、0.252 4、0.230 3 和0.212 1。熱浴時間為15 min時吸光度值最大。

6）冷卻時間為0 min、5 min、10 min、15 min、20min、25min、30min、35min、40min和45min的平均吸光度分別為0.265 7、0.275 4、0.285 6、0.309 8、0.291 7、0.285 4、0.274 3、0.273 1、0.262 4和0.264 9。冷卻時間為15 min時吸光度值最大。

最佳顯色條件為稱取一定量的蒽酮，以80%的濃硫酸為溶劑，配制成0.15%蒽酮－硫酸溶液，搖勻，備用。精密吸取一定量的樣品溶液，加入4倍量的顯色劑，搖勻，于90℃的水浴中熱浴15min，放入冰水混合物中冷卻15min后取出，于最大吸收波長處測定吸光度，根據(jù)吸光度值計算總多糖的含量。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 根據(jù)1.6.1項下方法進行試 驗，得 回 歸 方 程y＝6.290 5x＋0.156 8，R2＝0.999 5，結(jié)果表明葡萄糖在0.006 152～0.123 040mg具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 根據(jù)1.6.3項下方法進行試驗，結(jié)果RSD為1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 根據(jù)1.6.4項下方法進行試驗，結(jié)果RSD為2.34%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 根據(jù)1.6.5項下方法進行試驗，結(jié)果RSD為2.85%，表明樣品顯色后在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 由表2 可知，土茯苓切面紅色的平均回收率為94.60%，RSD＝1.35%（n＝6）；切面白色的平均回收率為100.66%，RSD＝1.96%（n＝6），均符合要求。

2.4 不同因素對土茯苓不同切面顏色總多糖含量的影響

2.4.1 提取方法 土茯苓切面紅色回流提取和超聲提取的總多糖平均含量分別為10.98% 和1.412%；切面白色回流提取和超聲提取的總多糖平均百分含量分別為34.94%和8.851%。結(jié)果表明，不同提取方法對土茯苓中總多糖的含量有較大影響，采用回流提取時，總多糖的含量較高，故選擇回流提取進行試驗。

表2 土茯苓不同切面顏色樣品總多糖的加樣回收率Table 2 Recovery rate of total polysaccharides in S.glabra with red and white transverse sections

2.4.2 提取溫度 在提取溫度為60℃、70℃、80℃、90℃和95℃時，土茯苓切面紅色的總多糖平均含量分別為2.383%、3.133%、3.886%、8.909%和8.676%，切面白色的總多糖平均含量分別為1.211%、9.877%、20.316%、34.77%和32.89%。結(jié)果表明，不同提取溫度對土茯苓總多糖的含量有較大影響，隨著提取溫度的升高，總多糖的溶出速率逐漸增大，當溫度為90℃時，總多糖的含量達最大值；當溫度為95℃時，總多糖的含量下降，表明較高溫度不利于總多糖的溶出。

2.4.3 提取時間 在提取時間為0.5h、1.0h、1.5h和2.0h時，土茯苓切面紅色的總多糖平均含量分別為9.039%、9.540%、10.82%和10.58%，切面白色的總多糖平均含量分別為33.04%、35.75%、37.46%和40.62%。結(jié)果表明，不同提取時間對土茯苓總多糖的含量有一定的影響，隨著提取時間的延長，總多糖的溶出速率逐漸增大，當提取時間為1.5h，切面紅色土茯苓的總多糖含量為最大值；當提取時間為2.0h，切面白色土茯苓的總多糖含量為最大值，這可能與切面白色土茯苓中總多糖含量較高有關(guān)，所需時間較長才能提取完全。

2.4.4 提取次數(shù) 在提取次數(shù)為1次、2次和3次時，土茯苓切面紅色的總多糖平均含量分別為8.338%、9.045%和5.521%，切面白色的總多糖平均含量分別為28.17%、32.45%和27.31%。結(jié)果表明，不同提取次數(shù)對土茯苓總多糖的含量有一定的影響，提取1次未能將多糖提取完全，當提取2次時，總多糖的含量為最大值。

2.4.5 料液比 在料液比為1∶10（g／mL）、1∶20（g／mL）、1∶30（g／mL）、1∶40（g／mL）和1∶50（g／mL）時，土茯苓切面紅色的總多糖平均含量分別為14.55%、9.850%、6.691%、6.331%和5.991%；切面白色的多糖平均含量分別為32.99%、37.93%、30.49%、26.73%和17.95%。結(jié)果表明，不同料液比對土茯苓總多糖的含量具有一定的影響，土茯苓切面紅色的料液比為1∶10（g／mL）時，總多糖含量較高；土茯苓切面白色的料液比為1∶20（g／mL）時，總多糖含量較高，這可能與切面白色土茯苓中總多糖含量較高有關(guān)，所需溶劑用量較大才能提取完全。

2.5 土茯苓不同切面顏色正交試驗各處理的總多糖含量

由表3可知土茯苓切面紅色和白色正交試驗各處理的總多糖含量。通過極差分析（表4）可知：切面紅色為A＞B＞C＞D，影響總多糖含量的因素依次為提取時間＞提取次數(shù)＞提取溫度＞料液比，最佳提取方案：A3B3C1D1，即用蒸餾水85℃回流提取1.5h，提取3次，料液比為1∶10（g／mL）。切面白色為B＞A＞D＞C，影響總多糖含量的因素依次為提取次數(shù)＞提取時間＞料液比＞提取溫度，最佳提取方案：A3B1C3D3，即用蒸餾水95℃回流提取2h，提取1次，料液比為1∶30（g／mL）。

將試驗結(jié)果進行方差分析，切面紅色的料液比離均差平方和與極差值分別為2.144和1.187，為4個因素中的最小值，故將其列為誤差項進行方差分析，用以檢驗其他因素作用的顯著性[8]，其中提取時間、提取次數(shù)、提取溫度的P值均大于0.05，表明各因素對試驗結(jié)果均無顯著性影響。然切面紅色土茯苓中提取時間與提取次數(shù)的P值均接近于0.05。通過LSD多重比較分析，提取2 次與3 次的P值小于0.05，兩者之間具有顯著性差異；而提取時間中，提取0.5h與1.0h、1.0h與1.5h之間的P值均小于0.05，表明2個總體均數(shù)之間具有顯著性差異；而提取0.5h與1.5h的P值大于0.05，兩者之間不具有顯著性差異。表明，長時間提取并非能達到有效提高其提取率的效果。

切面白色的提取溫度離均差平方和與極差值分別為29.545和4.420，為4 個因素中的最小值，故將其列為誤差項進行方差分析，用以檢驗其他因素作用的顯著性[8]，其中提取時間、提取次數(shù)、料液比的P值均大于0.05，表明各因素對試驗結(jié)果無顯著性影響。

表3 土茯苓切面紅色和白色的L9（34）正交試驗各處理的總多糖含量Table 3 Contents of total polysaccharides for S.glabra with red and white transverse sections in the L9（34）orthogonal test

表4 土茯苓切面紅色和白色正交試驗各因素水平的總多糖含量的均值與極差Table 4 The average content and range of total flavonoids of polysaccharides for S.glabra with red and wuite transverse section under different factor levels of orthogon test

圖示 土茯苓切面紅色和場面白色的總多糖含量（95%的置信區(qū)間）Fig.The box plot of total polysaccharides percentage contents in red and white transverse section of S.glabra（95%confidence interval）

綜上所述，土茯苓切面紅色總多糖的最佳提取工藝為蒸餾水85℃回流提取1.5h，提取3次，料液比為1∶10（g／mL）；土茯苓切面白色總多糖的最佳提取工藝為蒸餾水95℃回流提取2h，提取1次，料液比為1∶30（g／mL）。

將表3結(jié)果進行獨立樣本T 檢驗，比較數(shù)據(jù)之間的差異性。由圖示可知，2組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，統(tǒng)計學上具有顯著性差異，P＜0.01。即土茯苓切面紅色與切面白色的總多糖含量存在著較大差異，后者較高。

2.6 工藝驗證

按土茯苓切面紅色總多糖的最佳提取工藝A3B3C1D1提取，即用蒸餾水85℃回流提取1.5h，提取3次，料液比為1∶10（g／mL），平行3份樣，平均提取率為19.40%，RSD＝1.79%；按土茯苓切面白色總多糖的最佳提取工藝A3B1C3D3提取，即用蒸餾水95℃回流提取2h，提取1 次，料液比為1∶30（g／mL），平行3份樣，平均提取率為48.43%，RSD＝2.26%。表明，正交試驗所選參數(shù)合理，提取工藝重復性、穩(wěn)定性均較好。

3 結(jié)論與討論

1）通過正交優(yōu)化試驗，考察提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比等因素對土茯苓不同切面顏色總多糖提取率的影響，優(yōu)選出最佳提取工藝，并對該工藝進行了方法驗證，結(jié)果表明土茯苓切面紅色總多糖的最佳提取工藝為蒸餾水85℃回流提取1.5h，提取3次，料液比為1∶10（g／mL）；土茯苓切面白色總多糖的最佳提取工藝為蒸餾水95℃回流提取2h，提取1次，料液比為1∶30（g／mL）該方法重復性良好，工藝穩(wěn)定，該工藝下切面紅色和白色的多糖提取率分別為19.40%和48.43%土茯苓總多糖的提取率較高。同時，也為土茯苓篩選關(guān)鍵有效部位的藥效學試驗提供了最佳給藥組。

2）通過對蒽酮－硫酸比色法的顯色條件進行系統(tǒng)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，2010版《中國藥典》收載的顯色方法并非為最佳的顯色條件，因藥材及成分不同，顯色條件差異較大，故試驗中要根據(jù)具體的藥材進行顯色條件的優(yōu)化。同時，在試驗中，蒽酮－硫酸溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，檢測條件不同，空白溶液的配制亦不同，優(yōu)選蒽酮－硫酸溶液濃度時，需配制與樣品溶液相對應的5種空白溶液。

3）試驗采用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析，由方差分析結(jié)果可知，土茯苓不同切面顏色各因素的P值均大于0.05，然切面紅色土茯苓中提取時間與提取次數(shù)的P值均接近于0.05。通過LSD多重比較分析：提取2次與3次的P值小于0.05，兩者之間具有顯著性差異。提取時間中，提取0.5h 與1.0h、1.0h與1.5h之間的P值均小于0.05，表明2個總體均數(shù)之間具有顯著性差異；而提取0.5h與1.5h的P值大于0.05，兩者之間不具有顯著性差異，表明，長時間提取并非能達到有效提高其提取率的效果。表明，在實際生產(chǎn)中，將提取時間與提取次數(shù)作為工藝的主要影響因素，這為工業(yè)化生產(chǎn)中批量生產(chǎn)工藝的選擇提供了一定的試驗依據(jù)。

4）李時珍在《本草綱目》曾記載：“土茯苓，楚、蜀山箐中甚多，蔓生如莼，莖有細點，根狀如菝葜而圓，連綴而生，有赤白二種，入藥用白者良。研究發(fā)現(xiàn)，土茯苓切面白色的總多糖含量約為切面紅色的2倍，將兩個總體進行獨立樣本T 檢驗，結(jié)果兩組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異，表明土茯苓不同切面顏色總多糖的含量差異較大，其結(jié)果提示土茯苓可能存在一個未被認識的生態(tài)類型，該類型在貴州有著較為廣泛的分布。然而，歷代本草均認為，土茯苓“有赤白二種，入藥白者良”[9]，故總多糖是否為與該觀點相吻合的藥效學組分，還有待進一步研究。

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