液體培養(yǎng)真菌菌絲體及發(fā)酵液的高效分離方法

安子旋，呂曼曼，朱國棟，張佩佩，常 媛，劉志華，張榮沭＊

（1.東北林業(yè)大學 園林學院，黑龍江 哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱150040）

在微生物試驗中，經(jīng)常需要將液體培養(yǎng)的少量真菌菌絲體與其發(fā)酵液進行分離。在分離過程中由于不同屬的真菌菌絲體的形態(tài)特征、菌絲之間糾結(jié)程度和發(fā)酵液粘稠度不同，采用不同的分離方法會導致不同的菌絲收集效果。當需要利用菌絲體提取其總RNA、DNA 和蛋白時，如果收集的菌絲體中殘留少量的發(fā)酵液，其中的小分子化合物及蛋白等物質(zhì)會干擾試驗結(jié)果；相反，當需要研究真菌發(fā)酵液的特性及成分時，如果發(fā)酵液中殘留菌絲體也會干擾試驗結(jié)果。可見，采用高效的菌絲體與發(fā)酵液分離方法非常重要，將直接影響后續(xù)試驗的進程及結(jié)果。目前，多數(shù)實驗室均采用傳統(tǒng)的高速離心法和真空抽濾法分離菌絲體和發(fā)酵液[1－5]，然而，研究發(fā)現(xiàn)，這2種方法均存在操作步驟多、收集速度慢、耗電、成本高、對某些液體培養(yǎng)菌絲體收集效果差的缺點。為此，本研究建立一種快速節(jié)能的菌絲體與發(fā)酵液分離方法—多層紗布過濾法。為闡明多層紗布過濾法的優(yōu)點和實用性，本研究選取不同種屬具有代表性的6種真菌菌株，包括木霉屬的棘孢木霉、毛殼屬的球毛殼菌、核盤菌屬的核盤菌、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌、鏈格孢屬的鏈格孢菌和絲核菌屬的立枯絲核菌的菌株[6]，分別利用高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法從發(fā)酵液中收集菌絲體，通過比較其分離效果及試驗成本，闡明紗布過濾法的多種優(yōu)點，為同行提供一種快速節(jié)能、低成本的高效分離真菌菌絲體及發(fā)酵液的優(yōu)良方法。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及菌絲體獲得

木霉屬的棘孢木霉（Trichodermaasperellum）、毛殼屬的球毛殼菌（Chaetomiumglobosum）、鏈格孢屬的鏈格孢菌（Alternaliaalternate）、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）、核盤菌屬的核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）和絲核菌屬的立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）共6 種真菌菌種，均由東北林業(yè)大學森保學科提供（表1）。由于供試的6種真菌在液體PD 培養(yǎng)基中菌絲的繁殖速度不同，為了在同一時間能收集到適量菌絲體，采用不同的接菌量。其中，T.asperellum、A.alternate、F.oxysporum和C.globosum培養(yǎng)48h可獲得適量菌絲體，S.sclerotiorum和R.solani菌絲的繁殖速度相對較慢，培養(yǎng)120h后可收獲適量菌絲體。

表1 供試真菌種類及其培養(yǎng)菌絲體的接菌量和培養(yǎng)時間Table 1 Different species of fungi and inoculums of the cultured mycelium

1.2 主要儀器與培養(yǎng)基

超凈工作臺，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，減壓抽濾裝置，高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫水浴鍋，超低溫冰箱，臺式冷凍離心機，凝膠成像系統(tǒng)，核酸鑒定儀。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基，馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉18g，H2O 1 000mL，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基為不加瓊脂粉的PD 液體培養(yǎng)基。

1.3 試驗設計與培養(yǎng)方法

采用高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法從發(fā)酵液中收集菌絲體，比較3種方法的收集效果及試驗成本。

菌種活化。4℃保存的菌種轉(zhuǎn)接到新配制的PDA 斜面上，26℃培養(yǎng)5d，獲得分生孢子。

菌絲體培養(yǎng)。將PDA 斜面上生長好的分生孢子用一定體積的無菌水稀釋，測定孢子含量，將一定量的孢子懸液（表1）接入裝有100mL 的PD 培養(yǎng)液的三角瓶中，26℃200r／min振蕩培養(yǎng)。每種真菌均培養(yǎng)9瓶，分別用于高速離心法、真空抽濾法及紗布過濾法3種分離方法，每種分離方法設3次重復。

1.4 分離真菌菌絲體的方法

1.4.1 高速離心法 將6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物分別置于50mL離心管中，在20℃8 000r／min條件下離心10min，分離上清液，收集的菌絲體置于培養(yǎng)皿中。

1.4.2 減壓抽濾法 6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物分別用抽濾裝置進行常溫減壓抽濾，將菌絲體與發(fā)酵液分開。菌絲體保留在濾紙上，發(fā)酵液流入收集瓶中。

1.4.3 多層紗布過濾法 將折疊8層后的紗布放在培養(yǎng)皿中，分別將6種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物平攤于紗布，操作者戴無菌乳膠手套，將紗布細心卷起，雙手反向擰緊紗布，使發(fā)酵液與菌絲體分離，待無液體流下時，輕輕展開紗布，收集菌絲體。

1.5 測定方法

1.5.1 分生孢子計數(shù) 用血球計數(shù)器將真菌的孢子懸浮液在顯微鏡下計數(shù)。

1.5.2 菌絲體含水率 菌株培養(yǎng)一定時間后（表1），分別取不同菌種的發(fā)酵產(chǎn)物100 mL，采用高速離心、真空抽濾和紗布過濾3種方法收集菌絲體，精確稱量菌體濕重（g），然后將菌體在105℃下烘干至恒重，精確稱量干重。菌絲體含水率計算公式為：

菌絲體含水率＝（菌絲體鮮重－菌絲體干重）／菌絲體鮮重×100%。

1.6 提取真菌菌絲體的總RNA

將采用不同方法收集的6種真菌菌絲體分別稱取等重，液氮研磨。采用CTAB 方法[7]提取不同菌種、不同方法收集的菌絲體的總RNA。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件處理，結(jié)果以平均值±SD表示。采用Minitab 16統(tǒng)計軟件（Minitab，Version 16）進行ANOVA 分析，比較各方法之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體

6種真菌發(fā)酵一定時間后，其菌絲體大量生長。這6個菌種的發(fā)酵產(chǎn)物在菌絲的形態(tài)、發(fā)酵產(chǎn)物顏色和粘稠度等方面差異很大（圖1）。說明，研究選取的6種真菌各具代表性，且菌絲產(chǎn)量差異不大。

2.2 高速離心法分離的菌絲體與發(fā)酵液

采用高速離心法將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物離心后，6種真菌均表現(xiàn)為菌絲體與發(fā)酵液分離，形成絮狀或松散沉淀（圖2－1）。用移液器將上清液分離后，將菌絲體置于培養(yǎng)皿中發(fā)現(xiàn)，由于菌絲體很輕（只有球毛殼菌的菌絲球堅硬），并且發(fā)酵液粘稠，導致離心后收集的菌絲體中仍含有少量發(fā)酵液（圖2－2），說明，采用高速離心法很難將菌絲體與發(fā)酵液徹底分離。

圖1 振蕩培養(yǎng)一定時間后6種真菌的菌絲體Fig.1 State of the six fungal mycelium after shaking culture some time.

圖2 高速離心法收集的菌絲體Fig.2 The mycelia collected by high speed centrifuging method

2.3 減壓抽濾法分離的菌絲體與發(fā)酵液

采用減壓抽濾法將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行常溫減壓抽濾發(fā)現(xiàn)，6種真菌均表現(xiàn)為菌絲體與發(fā)酵液的分離速度差異極大（表2）。木霉菌的菌絲體與其發(fā)酵液很易分離，壓力減為0.02kpa時，只用1min，發(fā)酵液快速被抽濾到收集瓶中。球毛殼菌、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌的菌絲體則較難與其發(fā)酵液分離，在壓力減至0.08kpa時，達到圖3所示的分離效果，所需的抽濾時間分別為20 min、30 min和60min，而核盤菌和立枯絲核菌即使在壓力減至0.08kpa條件下，抽濾時間達60 min，收集到的菌絲體中還能見到有發(fā)酵液存在（表2；圖3－1中e和f），說明此方法用于收集不同菌種的菌絲體，其效果和用電成本存在很大差異。另外，收集的菌絲體與濾紙接合的緊密程度不同，如木霉、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌的菌絲體與濾紙接合緊密，需要小心細致才能將其從濾紙上剝離。而球毛殼菌的菌絲球堅硬，與濾紙接合松散，較易剝離，但菌球并沒有完全被抽癟，仍含有一定水分。雖然試驗中多數(shù)菌種的菌絲體與發(fā)酵液能很好地被分離，但這些菌絲體緊密附著于濾紙上，收集時間長，說明此方法用于不同菌種的分離，其分離效果、所用時間及成本均存在差異。

表2 6種菌絲體的抽濾時間和減壓壓力Table 2 Suction filtration time and decompression pressure

圖3 減壓抽濾法分離獲得的菌絲體Fig.3 Mycelium was separated by the vacuum filtration method

圖4 多層紗布過濾法分離的菌絲體Fig.4 The mycelium of six fungi was separately left on the dry gauze

2.4 多層紗布過濾法分離的菌絲體與發(fā)酵液

從圖4可見，采用多層紗布過濾法（將真菌的發(fā)酵產(chǎn)物用擰壓的力量）將菌絲體與發(fā)酵液分離，干燥菌絲體團塊的邊緣卷起，與紗布分離，易于剝離菌絲體。球毛殼菌堅硬的菌絲球也可以被壓擠成片，脫水效果優(yōu)于高速離心和減壓抽濾法。說明，多層紗布過濾方法操作簡單，成本低，無需使用電力設備，分離速度快，效果好。

2.5 不同分離法收集菌絲體的含水量

從表3看出，采用紗布過濾法收集的菌絲體的含水量均極顯著低于高速離心法（P＜0.01）。說明，紗布過濾法與高速離心法相比分離效果極好。另外，只有真菌S.sclerotiorum和R.solani采用紗布過濾法得到的菌絲體的含水量極顯著低于減壓過濾法（P＜0.01），其他4種真菌（T.asperellum、C.globosum、A.alternate和F.oxysporum）分離獲得的菌絲體的含水量與減壓過濾法相比雖然略低，但未達極顯著差異。說明，采用減壓過濾法分離菌絲體并不適合對S.sclerotiorum和R.solani的分離，分離后菌絲中的含水量較高。因此，采用紗布過濾法將真菌菌絲體與其發(fā)酵液分離的效果也優(yōu)于減壓過濾法。

表3 不同分離方法獲得的菌絲體的含水量Table 3 Moisture content of separating the mycelium by different methods %

表4 不同方法分離的菌絲體提取RNA的產(chǎn)量Table 4 The RNA yield of separating the mycelium in different methods

2.6 不同分離法收集菌絲體中提取的核酸質(zhì)量和產(chǎn)量

采用CTAB方法提取不同菌種、不同方法收集的菌絲體的總RNA 結(jié)果（表4）表明，6種真菌分別采用3種分離方法收集的菌絲體中均能提取出總RNA，并且RNA 的OD 值均在1.9～2.1。說明，采用這3種分離方法獲得的菌絲體中的RNA 均能滿足后續(xù)試驗的質(zhì)量要求。但對于同一菌種，3 種分離方法收集的等量菌絲體中提取的總RNA 的產(chǎn)量差異較大，其中，以采用紗布過濾法收集的菌絲體，其提取的總RNA 產(chǎn)量最高。說明，采用紗布過濾法分離菌絲體，比高速離心和減壓過濾法能獲得更高的核酸產(chǎn)量。

3 結(jié)論與討論

研究建立了一種快速節(jié)能的菌絲體與發(fā)酵液分離方法——多層紗布過濾法。該方法具有操作簡單、分離速度快，節(jié)能，成本低，收集的菌絲體含水量低，以及不影響菌絲體中提取的核酸質(zhì)量等許多優(yōu)點，非常實用，值得推廣。

目前，實驗室中多采用傳統(tǒng)的高速離心法和減壓抽濾法將菌絲體與發(fā)酵液分離。本研究選取6個不同種屬具有代表性的生長性狀差異極大的真菌菌株，分別采用高速離心、減壓抽濾和紗布過濾3種不同的分離方法收集菌絲體的效果表明，高速離心法即使離心速度很高也很難將真菌發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體完全密實地沉降到試管底部，導致分離上清液后收集到的菌絲體仍含有較多的水分，分離效果不好。而減壓抽濾法對這6種真菌的菌絲體進行分離時，對有些菌種的菌絲體收集效果好，對有些菌絲體的收集效果差，如收集的真菌S.sclerotiorum和R.solani的菌絲體的含水量仍然較高。并且，高速離心法和減壓抽濾法均須采用電動儀器設備（如高速離心機、真空抽濾泵等），存在操作步驟多、收集速度慢、耗電、成本高等問題。而本研究建立的紗布過濾法，操作簡單、成本低廉，只需要折疊8層、折疊后大小近似為30cm×12cm 的紗布、1副乳膠手套和1個15cm 直徑的培養(yǎng)皿即可。該方法廣泛適用于分離各種真菌的菌絲體及發(fā)酵液，與同行采用的傳統(tǒng)的高速離心法和減壓抽濾法相比，具有許多優(yōu)點。由此可見，多層紗布過濾收集菌絲體的方法非常實用，具有極大的推廣價值。

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