山莓莖皮總黃酮的提取及其抗氧化活性

石登紅，蔣華梅，劉 燕，王向前

（1.貴陽學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽550005；2.貴陽學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 貴陽550005；3.貴陽學(xué)院圖書館，貴州 貴陽550005）

山莓（RubuscorchorifoliusL.F.）又名懸鉤子、三月泡、山拋?zhàn)?、四月泡、刺葫蘆、饅頭菠、高腳菠、泡兒刺，系薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）中的一種落葉灌木[1]，野生資源除我國東北、甘肅、西藏、新疆、青海外，各省均有分布。山莓的根、莖、葉和果實(shí)均可入藥，有活血、解毒、止血等功效，是一種民間常用的苗族藥[2]。有關(guān)山莓果實(shí)的資源利用[3－5]、營養(yǎng)成分分析 等[6]研究已有文獻(xiàn)資料報(bào) 道。山莓栽培利用已成為傳統(tǒng)的重要水果[7－8]。但是，目前研究山莓葉的化學(xué)成分和藥用價(jià)值方面的文獻(xiàn)資料甚少[9－16]，國內(nèi)外對(duì)山莓的研究仍集中在資源利用、葉的藥用及果實(shí)食品加工等方面。

懸鉤子屬植物中黃酮類化合物的提取研究已有相關(guān)研究報(bào)道[17－18]，但是對(duì)山莓莖皮黃酮類物質(zhì)的提取和抗氧化性方面的研究尚未見報(bào)道。山莓資源在各地分布廣泛，為深入研究山莓莖皮的藥理活性物質(zhì)，提高山莓的藥用價(jià)值，筆者以貴州野生山莓為試驗(yàn)材料，利用有機(jī)溶劑回流提取法，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)山莓莖皮中的總黃酮進(jìn)行提取，并用分光光度法測(cè)定總黃酮含量，首次對(duì)山莓莖皮黃酮清除ABTS和DPPH自由基能力進(jìn)行研究，以期為貴州野生山莓莖皮提取物進(jìn)一步分離純化、抗氧化活性試驗(yàn)、單體分析等奠定基礎(chǔ)，為挖掘山莓莖皮的藥理作用、充分開發(fā)利用山莓資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

野生山莓莖皮采自貴州貴陽，采摘時(shí)間為3月，以當(dāng)年生嫩枝為主，分別采集山莓植株的上、中、下部位和四周，共采集20g，100℃恒溫干燥后研碎備用。

試劑為硝酸鋁Al（NO3）3、亞硝酸鈉（NaNO2）、無水乙醇（CH3CH2OH）、氫氧化鈉（NaOH），均為分析純，蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品≥97%（120℃干燥至恒重），ABTS和DPPH 均采自由Sigama公司提供。

儀器：UV－2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）、電子天平（美國奧豪斯）。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg于10mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，濃度為0.25mg／mL。

1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

采用Al（NO3）3法，參考文獻(xiàn)資料[16，19]精密移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL 于10 mL 比色管中，稀釋至2.40 mL，加5%亞硝酸鈉0.40 mL，搖勻，6min后加入10% Al（NO3）3水溶液0.40mL，搖勻放置6min，再加4% NaOH 4.00mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。以不加NaNO2的溶液為空白，采用紫外－可見分光光度法，在波長(zhǎng)400～800nm掃描[16－17]，以最大吸光度的波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00mL、0.01mL、0.02mL、0.03mL、0.04mL、0.05mL和0.06mL分別置于10 mL 的比色管中，按照1.3 的步驟稀釋，搖勻，最后靜置15min，用紫外－可見分光光度計(jì)在506nm 波長(zhǎng)下測(cè)定上述溶液的吸光度，以吸光度A 為縱坐標(biāo)，稀釋后各蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程及相關(guān)系數(shù)：C＝0.0911×A－0.0025，R2＝0.997 3。

1.5 山莓莖皮總黃酮的測(cè)定

準(zhǔn)確移取山莓莖皮提取液各0.5mL，按1.3的方法顯色，并測(cè)定吸光度，將吸光度值代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出待測(cè)樣品的濃度，根據(jù)公式：樣品總黃酮質(zhì)量（mg）＝濃度×10×100／0.5，總黃酮含量（mg／g）＝樣品總黃酮質(zhì)量／樣品質(zhì)量，計(jì)算各樣品總黃酮質(zhì)量和含量。

1.6 不同因素的考察

1.6.1 乙醇濃度 稱取1g的山莓莖皮粉末4份分裝入250mL燒瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30mL，70℃回流提取2h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復(fù)提取1次，合并濾液，用相應(yīng)濃度的乙醇定容到100mL的容量瓶中，按1.5的方法進(jìn)行總黃酮的測(cè)定（下同）。

1.6.2 料液比 稱取1g山莓莖皮粉末4份分裝于250mL 燒瓶中，分別加入料液比（g／mL）為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的70%乙醇溶液，80℃回流提取2h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復(fù)提取1次，合并濾液，定容到100mL的容量瓶中。

1.6.3 回流溫度 稱取1g山莓莖皮粉末4份分裝于250mL燒瓶中，加入70%乙醇溶液各30mL，分別在50℃、60℃、70℃、80℃回流提取2h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復(fù)提取1次，合并濾液，定容到100mL的容量瓶中。

1.6.4 提取時(shí)間 稱取1g山莓莖皮粉末4份分裝于250mL燒瓶中，加入70%乙醇溶液各30mL，于80℃分別回流提取2h、3h、4h、5h，抽濾，收集濾液，同樣條件下重復(fù)提取1次，合并濾液，定容到100mL的容量瓶中。

1.7 山莓莖皮總黃酮提取條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、回流溫度（C）和提取時(shí)間（D）為考察因素，以山莓莖皮總黃酮含量為指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平見表1。

表1 山莓莖皮總黃酮提取的L9（34）正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels for L9（34）orthogonal test fromR.corchorifolius stem barks

1.8 抗氧化活性試驗(yàn)

1.8.1 清除ABTS自由基 精密稱取0.096 0g ABTS，蒸餾水溶解、定容至25 mL 容量瓶，濃度7mmol／L，記為試劑1。稱取0.378 4g K2S2O8（過硫酸鉀），蒸餾水溶解、定容至10 mL 容量瓶，濃度140mmol／L，記為試劑2。精密吸取5 mL 試劑1于10mL容量瓶，加入88μL 試劑2，搖勻，避光放置12～16h，即為ABTS儲(chǔ)備液。移取一定體積的ABTS 儲(chǔ) 備 液，用75% 乙 醇 溶 液 稀 釋100 倍，732nm測(cè)吸光值在0.7±0.0。按上述1∶100的比例配制ABTS溶液用于清除ABTS自由基試驗(yàn)。

樣品溶液：吸取正交試驗(yàn)中總黃酮含量較高的溶液0.5mL，用75%乙醇稀釋至3 mL，即為樣品溶液。

分別取樣品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL和65μL，用75%乙醇將樣液稀釋至0.5mL，每管中加入0.3mmol／L的ABTS溶液2.5mL，振搖10s以上，避光靜置10min，用75%乙醇作空白對(duì)照，于742nm 下測(cè)吸光度值，計(jì)算清除率。BHT樣品溶液 濃度1.5 mmol／L，分別取BHT 溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL和50μL按上述步驟進(jìn)行清除ABTS試驗(yàn)，計(jì)算清除率。

式中，A0為空白對(duì)照吸光度，A樣為樣品吸光度。根據(jù)濃度與清除率求出一元線性方程、相關(guān)系數(shù)，計(jì)算半數(shù)清除率IC50值。

1.8.2 清除DPPH 自由基 分別吸取正交試驗(yàn)總黃酮含量較高的樣品溶液0.02 mL、0.04 mL、0.06mL、0.08 mL、0.10 mL、0.12 mL、0.14 mL、0.16mL和0.18mL于10mL比色管中，用75%乙醇溶液定容至4 mL，振蕩搖勻，分別加入0.3mmol／L的DPPH 溶液4 mL，振蕩搖勻，空白對(duì)照為75% 乙醇，常溫避光反應(yīng)60 min 后于523nm測(cè)吸光度值，采用以下公式計(jì)算清除率[11]。BHT 樣品溶液濃度7.5 mmol／L，分別取BHT 溶液0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10mL、0.12mL、0.14mL、0.16mL、0.18mL和0.20mL按上述步驟進(jìn)行清除DPPH 試驗(yàn)，計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)山莓莖皮總黃酮含量的影響

由表2可知，不同乙醇濃度、料液比、回流溫度、提取時(shí)間對(duì)山莓莖皮中總黃酮提取率均有影響。

1）乙醇濃度。隨乙醇濃度升高總黃酮提取率逐漸降低，當(dāng)乙醇濃度超過90%以后提取率下降最明顯。因此，選擇60%、70%、80%的乙醇濃度作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2）料液比。在同等條件下，料液比與總黃酮提取率成正比，當(dāng)料液比在1∶20～1∶40時(shí)，提取率增加顯著，超過1∶50后提取率增加緩慢?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的效益，選擇料液比1∶30、1∶40、1∶50作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

3）提取溫度。提取溫度在50～70℃，總黃酮提取率隨溫度的升高而顯著增大，但溫度為80℃時(shí)提取率降低。因此，選擇提取溫度60℃、70℃、80℃作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

4）提取時(shí)間?？傸S酮提取率隨提取時(shí)間的增加而增大，可見提取時(shí)間越長(zhǎng)，總黃酮提取越充分，但當(dāng)時(shí)間超過3h時(shí)，提取率明顯下降。同樣，考慮實(shí)際生產(chǎn)的效益，選擇提取時(shí)間2h、3h、4h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2 山莓莖皮正交試驗(yàn)各處理的總黃酮含量

對(duì)山莓莖皮總黃酮提取的正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）進(jìn)行極差分析（表4）可知，極差RA＞RC＞RB＞RD，4個(gè)因素對(duì)山莓莖皮中總黃酮提取率的影響大小依次為乙醇濃度（A）＞回流溫度（C）＞料液比（B）＞提取時(shí)間（D）。4個(gè)因素中，乙醇濃度和回流溫度的影響作用最顯著，其次是料液比，影響最小的是提取時(shí)間。根據(jù)4 個(gè)因素的k1、k2和k3值大小可知，A因素A1＞A2＞A3，B因素B1＞B2＞B3，C因素C3＞C1＞C2，D 因素D3＞D2＞D1。因此，乙醇回流提取山莓莖皮總黃酮的最佳工藝條件為A1B1C3D3，即乙醇濃度60%、料液比1∶30、回流溫度80℃、提取時(shí)間4h，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得總黃酮提取量為28.811 mg／g。

表2 不同乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間的山莓莖皮總黃酮含量Table 2 Total flavonoids extracted fromR.corchorifolius stem barks with various ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction temperature and time

表3 山莓莖皮L9（34）正交試驗(yàn)各處理的總黃酮含量Table 3 Total flavonoids contents of different L9（34）orthogonal test treatments of R.corchorifolius stem barks

表4 山莓莖皮正交試驗(yàn)各因素水平總黃酮含量的均值與極差Table 4 The average and range of total flavonoids in the stem bark of R.corchorifolius at different conditions

圖示 山莓莖皮黃酮和BHT不同濃度對(duì)ABTS和DPPH 自由基的清除率Fig.ABTS and DPPH free radical－savenging rates of flavonoids from the bark of R.corchorifolius and BHT

2.3 山莓莖皮黃酮清除ABTS和DPPH自由基的能力

BHT 是人工合成的抗氧化劑，具有提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和保持品質(zhì)等效果，但是有對(duì)人體造成潛在傷害的弊端[20]。由圖示可見，山莓莖皮黃酮的提取液對(duì)ABTS和DPPH 自由基具有明顯的清除效果，清除能力比BHT 高，且隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率也隨著增大，但增加到一定的質(zhì)量濃度時(shí)，清除率增大幅度趨于平緩。在黃酮、BHT 抗氧化劑的質(zhì)量濃度較低時(shí)，2種溶液對(duì)ABTS和DPPH 自由基的清除率（y）與質(zhì)量濃度（x）之間呈近似線性關(guān)系（表5）?？梢?，山莓莖皮黃酮的提取液具較強(qiáng)的抗氧化性，山莓黃酮提取液對(duì)ABTS和DPPH 自由基清除率達(dá)50%時(shí)，IC50值均低于合成抗氧化劑BHT 的IC50值，因此有望成為一種天然抗氧化劑。

表5 清除率與抗氧化劑加入量的線性關(guān)系及抗氧化劑IC50值Table 5 Relationship between scavenging rate and antioxidant concentration and IC50of antioxidants

3 結(jié)論

1）正交試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇回流提取山莓莖皮總黃酮最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%、料液比1∶30、回流溫度80℃、提取時(shí)間4h，在此提取條件下，山莓莖皮中總黃酮的含量可達(dá)28.811mg／g。

2）貴州春季野生山莓莖皮中總黃酮的含量高達(dá)28.811mg／g，高于文獻(xiàn)報(bào)道的山莓葉春季總黃酮含量1.463 7mg／g[16]。說明，黔產(chǎn)野生山莓莖皮蘊(yùn)含豐富的總黃酮資源。

3）經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，山莓莖皮黃酮提取液對(duì)ABTS和DPPH 自由基清除率達(dá)50%時(shí)，IC50值均低于合成抗氧化劑BHT 的IC50值，因此具較好的抗氧化性，有望成為一種天然抗氧化劑，為進(jìn)一步開發(fā)與利用野生山莓資源提供科學(xué)依據(jù)。

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