烏司他丁對(duì)熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及炎癥因子釋放的影響

潘志國(guó)，邵玉，耿焱，陳鏡合，蘇磊

烏司他丁對(duì)熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及炎癥因子釋放的影響

潘志國(guó)，邵玉，耿焱，陳鏡合，蘇磊

目的 探討烏司他丁對(duì)熱打擊血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及炎癥因子釋放的影響。方法 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)細(xì)胞分為對(duì)照組及不同劑量(1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000U/ml)烏司他丁組，采用CCK-8法檢測(cè)不同劑量烏司他丁對(duì)熱打擊下HUEVC細(xì)胞增殖的影響。另將HUVEC分為對(duì)照組、43℃熱打擊組及43℃熱打擊+烏司他丁組，采用ELISA法測(cè)定烏司他丁對(duì)熱打擊條件下HUVEC細(xì)胞炎癥因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)釋放的影響。結(jié)果 不同劑量烏司他丁對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖均無(wú)明顯抑制作用(P>0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)后即刻(0h)，43℃熱打擊+烏司他丁組IL-6、TNF-α的釋放較對(duì)照組及43℃熱打擊組明顯降低(P＜0.05)；6h時(shí)43℃熱打擊+烏司他丁組IL-6、TNF-α的釋放較43℃熱打擊組仍明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論 烏司他丁對(duì)熱打擊下的HUEVC細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，但可抑制細(xì)胞IL-6和TNF-α的釋放。

烏司他??；中暑；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖

中暑是一種嚴(yán)重威脅人民群眾生命的疾病，是我國(guó)南方地區(qū)夏季的一種常見(jiàn)病，尤其在軍事訓(xùn)練中時(shí)有發(fā)生[1]。國(guó)外流調(diào)顯示中暑的病死率為10%～15%，一旦發(fā)展為重癥中暑合并多器官功能衰竭(MODS)，則病死率可達(dá)40%以上，即使存活也有30%以上遺留長(zhǎng)期的神經(jīng)系統(tǒng)等各類后遺癥[2-4]。多項(xiàng)研究表明，在重癥中暑的病理生理過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞既是參與炎癥應(yīng)答的主要細(xì)胞之一，亦是炎癥損害的靶細(xì)胞[5]。我們前期的臨床研究通過(guò)檢測(cè)重癥中暑患者外周血循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量、血清血管假性血友病因子(vWF)以及血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)溶度，發(fā)現(xiàn)烏司他丁使重癥中暑患者培養(yǎng)上清脫落血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，vWF和TM濃度下降[6]。筆者前期實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)熱打擊對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)，可抑制其增殖，并促進(jìn)炎癥因子白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的釋放[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討烏司他丁對(duì)熱打擊下體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及炎癥因子釋放的影響，以進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞在重癥中暑發(fā)生及發(fā)展中的作用，尋找可能有效的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUEVC)為廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科創(chuàng)建并保存。人IL-6和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自中國(guó)CUSABIO和ExCell公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，烏司他丁購(gòu)自天普公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞復(fù)蘇后，置于離心管中1000r/min離心10min，棄上清，用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，10萬(wàn)U/L青霉素、100mg/L鏈霉素)混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)入25ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2濃度及飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每48～72h更換培養(yǎng)液一次，每周傳代1～2次。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)烏司他丁對(duì)熱打擊下HUVEC細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔密度鋪入可拆卸96孔板，培養(yǎng)24h后，更換無(wú)血清高糖DMEM(100μl/孔)培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞分為對(duì)照組和1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000U/ml組，除對(duì)照組外，其余各組加入相應(yīng)濃度烏司他丁，并設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，過(guò)夜培養(yǎng)。于每組細(xì)胞上清中加入10μl CCK-8，重新置于標(biāo)準(zhǔn)37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm處讀取吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，再次計(jì)算細(xì)胞增殖率。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[8]。

1.2.3 雙抗體夾心ELISA法測(cè)定烏司他丁對(duì)HUVEC熱打擊下IL-6、TNF-α釋放的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×105個(gè)/皿密度鋪入60mm×15mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至單層融合后，更換無(wú)血清高糖DMEM(1.5ml/皿)培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(細(xì)胞于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h)、43℃熱打擊組(細(xì)胞于43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h)和43℃熱打擊+烏司他丁組(細(xì)胞培養(yǎng)液中加入3000U/ml烏司他丁并于43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h)。分別于培養(yǎng)后即刻(0h)以及6h(置于37℃)后取上清待檢。按CUSABIO和ExCell公司試劑盒說(shuō)明，采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-6 和TNF–α濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，在方差齊性基礎(chǔ)上多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 烏司他丁對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0h)比較，各種劑量組細(xì)胞24、48、72h增殖率均無(wú)明顯下降(P>0.05)。且相對(duì)于未加烏司他丁的對(duì)照組，其他各劑量烏司他丁組對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯抑制作用(P>0.05，圖1)。

圖1 不同劑量烏司他丁對(duì)HUVEC細(xì)胞活力及增殖的影響Fig.1 Influence of ulinastatin on activity and proliferation of HUVEC cells

2.2 烏司他丁對(duì)熱打擊下HUVEC細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 與對(duì)照組比較，43℃熱打擊+烏司他丁組在0h時(shí)的IL-6、TNF-α釋放均較對(duì)照組及43℃熱打擊組明顯降低(P＜0.05)。43℃熱打擊+烏司他丁組HUVEC細(xì)胞在6h時(shí)的IL-6、TNF-α釋放均較43℃熱打擊組明顯降低(P＜0.05，圖2)。

3 討 論

目前認(rèn)為重癥中暑是一種繼發(fā)于熱損傷之后的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，進(jìn)而發(fā)展為類膿毒癥，引發(fā)多臟器功能衰竭的過(guò)程[9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞與炎癥細(xì)胞的功能異常被視為重癥中暑發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)[3,10]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，重癥中暑的死因包括：①全身炎癥細(xì)胞的活化，如單核細(xì)胞的遷移和跨血管壁運(yùn)動(dòng)；②廣泛出血和血栓形成(彌散性血管內(nèi)凝血即DIC)；③廣泛血管床內(nèi)皮細(xì)胞損傷[11-12]，以上病理變化最后均作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在重癥中暑動(dòng)物模型中多臟器血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能均受到損害，損傷血管內(nèi)皮可促進(jìn)白細(xì)胞和血小板黏附，為中暑炎癥損傷和血栓形成提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。目前重癥醫(yī)學(xué)將血管內(nèi)皮看作一個(gè)特殊的器官系統(tǒng)，有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是影響重癥中暑病理生理序貫進(jìn)展的關(guān)鍵因素[5]，血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅是炎癥反應(yīng)中的被動(dòng)靶細(xì)胞，也是一種效應(yīng)細(xì)胞，影響重癥中暑的發(fā)生發(fā)展。

圖2 烏司他丁對(duì)熱打擊條件下HUVEC細(xì)胞炎癥因子釋放的影響Fig.2 Influence of ulinastatin on IL-6 and TNF-α release of HUVEC under heatshock

烏司他丁是從人尿液中提取的一種彈性蛋白酶抑制物，因其具有抗炎、減輕細(xì)胞與組織損傷、改善微循環(huán)與內(nèi)皮細(xì)胞通透性等作用，廣泛應(yīng)用于胰腺炎、急性肺損傷和膿毒癥等的治療[14-17]。有研究稱烏司他丁能維護(hù)血管正常舒縮功能及內(nèi)皮細(xì)胞完整性，使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子-1和CD11b明顯減少，白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附減少，明顯減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[14]。因此，烏司他丁對(duì)于抑制全身過(guò)度的炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受炎癥傷害具有重要意義。有文獻(xiàn)指出，烏司他丁對(duì)患者機(jī)體無(wú)明顯毒副作用，并建議增大治療劑量[18-19]。本研究CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0h)比較，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24、48、72h增殖率均無(wú)明顯下降(P>0.05)，且各劑量組烏司他丁對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖均無(wú)明顯抑制作用(P>0.05)。

在本研究中，相對(duì)于37℃對(duì)照組，在給予3000U/ml烏司他丁與HUVEC細(xì)胞共孵育1h后，檢測(cè)0h及6h組細(xì)胞上清炎癥因子IL-6、TNF-α的濃度，結(jié)果顯示，在加入烏司他丁共孵育且經(jīng)歷43℃熱打擊1h后，不但在0h組HUVEC細(xì)胞IL-6、TNF-α的釋放受到抑制(P＜0.05)，在6h后，加入烏司他丁共孵育的HUVEC細(xì)胞上清中的IL-6、TNF-α均較43℃有所下降(P＜0.05)。提示烏司他丁可抑制熱打擊后IL-6、TNF-α的分泌，且可持續(xù)6h。

總之，針對(duì)烏司他丁在熱打擊中對(duì)HUVEC細(xì)胞作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有助于進(jìn)一步了解重癥中暑發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制以及尋找新的有效治療藥物。

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Influence of ulinastatin on the proliferation of vascular endothelial cells and IL-6 and TNF-α release under heat stress

PAN Zhi-guo1, SHAO Yu2, GENG Yan1, CHEN Jing-he3, SU Lei1*1Department of Intensive Care Unit, The Military Key Laboratory of Trauma Care in Hot Zone and Tissue Repair in PLA,2Department of Overseas Chinese, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China
3Department of Internal Medicine, First Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
*

, E-mail: slei_icu@163.com
This work was supported by the “Twelfth-Five Year” Plan Key Projects of Military Medicine Science and Technology Development (BWS12J018) and Science and Technology Plan of Guangdong Province (2013B031800010)

ObjectiveTo explore the influence of ulinastatin on the proliferation of vascular endothelial cells and release of IL-6 and TNF-α under heat stress.MethodsHUVEC cells were divided into control, and ulinastatin of different dosage groups (1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000U/ml), and CCK-8 assay was used to investigate the influence of ulinastatin on the proliferation of vascular endothelial cells. HUVEC cells were also divided into control, 43℃ heat stress, and 43℃ heat stress plus ulinastatin groups. ELISA assay was used to determine the effect of ulinastatin on the release of IL-6 and TNF-α.ResultsAll the above mentioned doses of ulinastatin showed no significant inhibitory effect on proliferation of HUVEC cells (P>0.05). ELISA results showed that, compared with control group and 43℃ heat-stress group, both the IL-6 and TNF-α releases were decreased at 0h in treatment group with ulinastatin (P<0.05). The IL-6 and TNF-α releases were much lower at 6h in the treatment group with ulinastatin than those undergoing 43℃ heat-stress only group (P<0.05).ConclusionsVarious doses of ulinastatin have no effect on proliferation of endothelial cells. However, it can inhibit the IL-6 and TNF-α releases from HUEVC cells under heat stress.

ulinastatin; heat stroke; endothelial cell; cell proliferation

R594.12

A

0577-7402(2015)05-0362-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.06

2014-12-14；

2015-04-07)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究“十二五”發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS12J018)；廣東省科技計(jì)劃(2013B031800010)

潘志國(guó)，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。主要從事急危重癥救治與重癥中暑方面的研究

510010 廣州 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(潘志國(guó)、耿焱、蘇磊)，華僑科(邵玉)；510405 廣州 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(陳鏡合)

蘇磊，E-mail: slei_icu@163.com