eNOS解偶聯(lián)對(duì)減壓病大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的影響

林海珊，歐敏，方以群

eNOS解偶聯(lián)對(duì)減壓病大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的影響

林海珊，歐敏，方以群

目的 探討不安全減壓對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法 60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=30)和減壓病(DCS)組(n=30)。將DCS組大鼠置于加壓艙內(nèi)，暴露于600kPa壓縮空氣環(huán)境下60min，再以100kPa/ min減至常壓，制作DCS模型。DCS組存活大鼠及對(duì)照組大鼠麻醉后剝離肺動(dòng)脈，檢測(cè)離體肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴的血管舒張能力，采用Western blotting檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)情況及其解離情況，以及肺動(dòng)脈組織中各蛋白硝基化水平，行離體肺動(dòng)脈超氧化物陰離子探針(DHE)染色檢測(cè)活性氧(ROS)形成情況。結(jié)果 DCS組30只大鼠經(jīng)歷不安全減壓后死亡10只，存活大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴的血管舒張能力明顯下降(P<0.05)。DCS組及對(duì)照組eNOS表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但DCS組eNOS單體/二聚體比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；DCS組肺動(dòng)脈組織各蛋白酪氨酸硝基化水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。DHE染色結(jié)果顯示，DCS組肺動(dòng)脈中ROS生成量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 模擬潛艇逃生過(guò)程中不安全減壓可導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮中eNOS二聚體解偶聯(lián)，解離的eNOS單體不能合成NO，從而影響血管內(nèi)皮依賴舒張能力；eNOS單體可促進(jìn)ONOO–合成，導(dǎo)致肺動(dòng)脈組織中蛋白酪氨酸硝基化水平提高，引起細(xì)胞信息調(diào)控紊亂，eNOS單體還可引起活性氧離子ROS形成增加，從而介導(dǎo)過(guò)氧化損傷。

減壓??；一氧化氮合酶Ⅲ型；超氧陰離子；3-硝基酪氨酸

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，不安全減壓可導(dǎo)致血管及組織內(nèi)氣泡形成，而減壓性血管內(nèi)氣泡形成后是否導(dǎo)致循環(huán)障礙與血管功能狀態(tài)有直接關(guān)系[1]。相關(guān)研究表明，不管氣泡的直徑是否大于血管管徑(實(shí)際上每一個(gè)可見(jiàn)氣泡的直徑都大于微血管管徑，至少必定大于毛細(xì)血管的管徑)，氣泡的流速、流向、流態(tài)完全取決于血管的功能狀態(tài)，在血流、血壓的作用下都易變形通過(guò)各種管徑的血管隨血液進(jìn)入循環(huán)。只有當(dāng)血液停滯和血管痙攣閉鎖、氣泡無(wú)出路、血壓的作用力小于血管閉合時(shí)，其內(nèi)的氣泡才呈靜止?fàn)顟B(tài)[2]，從而引起減壓病(decompression，DCS)癥狀。因此，我們推測(cè)不安全減壓過(guò)程中，血管舒張能力障礙可導(dǎo)致DCS的產(chǎn)生。

血管舒張分為內(nèi)皮依賴性血管舒張及非內(nèi)皮依賴性血管舒張。非內(nèi)皮依賴性血管舒張可由乙酰膽堿、緩激肽等刺激引起，主要為生理刺激引起的血管舒張。NO是內(nèi)皮依賴性血管舒張的重要因子[3]，由一氧化氮合酶(NOS)合成。NOS包括eNOS、iNOS、nNOS三型。nNOS為神經(jīng)型，多位于神經(jīng)元細(xì)胞；iNOS為誘導(dǎo)型，在炎癥的病理狀態(tài)下可誘導(dǎo)生成；eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，可合成生理需要量的NO，eNOS在二聚體形態(tài)下將左旋精氨酸轉(zhuǎn)化為NO，當(dāng)eNOS解離為單體時(shí)則不能正常合成NO，而生成大量超氧陰離子O2，O2與NO反應(yīng)生成大量ONOO–[4]，對(duì)重要蛋白進(jìn)行氮化修飾，改變信號(hào)途徑，直接和(或)間接介導(dǎo)了NO的細(xì)胞毒性效應(yīng)。DCS中血管損傷是否與eNOS解偶聯(lián)相關(guān)目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料及設(shè)備 雄性二級(jí)SD大鼠60只，體重210±25g，購(gòu)自海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK(滬)2008-0016?？瓜趸野彼峥贵w(anti-3-nitrotyrosine antibody，ab110282)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。eNOS抗體購(gòu)自德國(guó)BD Bioscience公司。超氧陰離子探針DHE(Dihydroethidium)及不含2-巰基乙醇的上樣緩沖液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Krebs-Henseleit(K-H)溶液(mmol/L)：NaCl 119，NaHCO325，MgCl21.19， KCl 4.7，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高鉀K-H溶液(含60mmol/L KCl)：NaCl 63.7，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 60，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高鉀無(wú)鈣液：用EGTA(0.05)代替高鉀溶液中的CaCl2，其余成分與高鉀溶液相同。RIPA裂解緩沖液：100ml RIPA Buffer，50mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150mmol/L NaCl，1%NP-40，0.1%SDS。儲(chǔ)存：4℃，2μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑，于使用前加入)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：0.3m3加壓艙(山東宏遠(yuǎn)公司)，610M型多通道血管張力檢測(cè)儀(DMT公司，丹麥)，Power Lab 8/30生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(AD公司，澳大利亞)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。Stemi DV4型體視顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作 60只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為2組。對(duì)照組：將30只大鼠置于0.3m3的加壓艙(用于小型動(dòng)物復(fù)現(xiàn)DCS模型)，不予加壓處理，停留65min，持續(xù)通入空氣，維持二氧化碳(CO2)水平低于300mg/L，艙內(nèi)濕度維持在40%～60%，溫度維持在27～30℃，大鼠在艙內(nèi)可自由活動(dòng)，研究者可通過(guò)閉路電視觀察大鼠艙內(nèi)行為。DCS組：將30只大鼠置于與對(duì)照組相同的加壓艙內(nèi)，并設(shè)置相同的溫度、濕度。以100kPa/min的速度將艙內(nèi)空氣加壓至600kPa(相當(dāng)于60米海深所處的壓力)維持60min，并持續(xù)通入空氣，維持CO2水平低于300mg/L，并以相同速度減壓至常壓。

1.2.2 標(biāo)本收集 兩組動(dòng)物出艙后觀察動(dòng)物行為變化及死亡發(fā)生率。1h后存活大鼠用1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)，開(kāi)胸取心肺組織，冰浴條件下剝離肺動(dòng)脈組織，每組各留8段肺動(dòng)脈組織置于K-H液中，立即行離體血管張力檢測(cè)及DHE染色，其余組織凍存于–80℃中以備Western blotting檢測(cè)。

1.2.3 動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的檢測(cè) 血管標(biāo)本取出后，迅速置于通入含混合氣體(95%O2+5%CO2)的K-H營(yíng)養(yǎng)液(pH 7.4，4℃)中，制備血管環(huán)(3～4mm)，懸掛于內(nèi)置10ml營(yíng)養(yǎng)液并含消炎痛(10–5mol/L，抑制內(nèi)源性前列環(huán)素系統(tǒng))的生理浴槽中，恒速通入混合氣體，恒溫37.0±0.5℃，靜息負(fù)荷為4g，通過(guò)張力換能器將采集信號(hào)傳入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中，記錄血管環(huán)的張力變化。首先用含60mmol/L KCl的高鉀溶液刺激血管，檢測(cè)血管張力的反應(yīng)性。把浴槽內(nèi)的K-H液換成含高鉀的K-H液。高鉀使冠狀動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生收縮反應(yīng)，維持5min待張力穩(wěn)定后，以5min末的激活張力(單位為mN/mm)作為100%，充分沖洗至基線。先用去甲腎上腺素預(yù)收縮血管環(huán)，待張力穩(wěn)定后加入乙酰膽堿(Ach)，記錄血管張力的變化，測(cè)定其對(duì)Ach (10–9～10–4mol/L)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。為檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中Ach所誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)是否為內(nèi)皮源性NO所介導(dǎo)，部分血管環(huán)拭去內(nèi)皮或預(yù)先以NOS抑制劑L-NAME(3×10–4mol/L)預(yù)處理15min后再行檢測(cè)。

1.2.4 肺動(dòng)脈3-硝基酪氨酸、eNOS單體及二聚體的檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)水平。每只大鼠取等量肺動(dòng)脈組織，每10mg加0.1ml RIPA，勻漿機(jī)電動(dòng)勻漿。注意保持低溫(埋在冰中)，快速勻漿。將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，4℃下12 000g離心2～3min。取上清液加上樣緩沖液后，加熱至98℃，5min。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Bio-Rad公司產(chǎn)品)，加入含一抗(兔抗鼠1:1000稀釋)的反應(yīng)液，然后加入羊抗兔IgG二抗(1:4000稀釋)。eNOS單體及二聚體檢測(cè)，組織樣本處理過(guò)程中加入不含巰基乙醇的上樣緩沖液，且兩者混合后無(wú)需加熱，于4℃下行SDS-聚丙烯胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入含一抗(兔抗鼠，稀釋比例為1:500)的反應(yīng)液孵育過(guò)夜，后續(xù)步驟同前。結(jié)果采用國(guó)產(chǎn)HP IAS21000型圖像分析儀測(cè)定平均光密度值。

1.2.5 肺動(dòng)脈ROS測(cè)定 每組各取6只存活大鼠，分別于處死前30min尾靜脈注射DHE(100μmol/L，0.1ml/10g)熒光染料，30min后麻醉取肺動(dòng)脈組織，冰凍切片包埋劑(OCT)包埋，–20℃冷凍，用冰凍切片機(jī)10μm切片，PBS洗3次，抗熒光淬滅劑封固，熒光顯微鏡觀察大鼠肺動(dòng)脈組織的ROS含量(紅色熒光)。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果以相對(duì)熒光強(qiáng)度單位表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料±s表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)皮依賴的血管舒張功能 在10–5mol/L去甲腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)上，DCS組ACh誘導(dǎo)的血管最大舒張反應(yīng)百分比(12.5%±3.2%)明顯低于對(duì)照組(48.6%±4.3%，P<0.05)，提示DCS模型大鼠血管內(nèi)皮依賴舒張功能明顯受損。經(jīng)去內(nèi)皮或3×10–4mol/L L-NAME預(yù)處理后，血管環(huán)對(duì)ACh不再產(chǎn)生明顯的舒張效應(yīng)，提示這種舒張效應(yīng)為內(nèi)皮源性NO所介導(dǎo)(圖1)。

圖1 大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴血管舒張能力變化Fig.1 Changes of the endothelium dependent vasodilatation function in rats

2.2 3-硝基酪氨酸在肺動(dòng)脈組織中的表達(dá) DCS組肺動(dòng)脈組織3-硝基酪氨酸相對(duì)表達(dá)水平(256±7)明顯高于對(duì)照組(178±7)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.3 eNOS單體及二聚體的檢測(cè) 對(duì)照組與DCS組中eNOS總量比較未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)，表明eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中恒定表達(dá)。eNOS單體/二聚體比值在DCS組中明顯升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.4 肺動(dòng)脈ROS檢測(cè)結(jié)果 DHE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺動(dòng)脈組織中ROS生成量較少，熒光強(qiáng)度較弱。而經(jīng)歷不安全減壓后，DCS組大鼠肺動(dòng)脈組織中ROS生成量明顯增加，肺動(dòng)脈紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。圖像分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DCS組大鼠肺動(dòng)脈組織中ROS生成量明顯增加(P<0.05，圖4)。

圖2 大鼠肺動(dòng)脈組織3-硝基酪氨酸表達(dá)(±s，n=8)Fig.2 Expression level of 3-nitrotyrosine in pulmonary artery tissue of rats (±s, n=8)

圖3 大鼠肺動(dòng)脈組織eNOS表達(dá)量以及其單體和二聚體表達(dá)量(±s, n=8)Fig.3 Expression of eNOS and its monomer/dimer in pulmonary artery tissue of rats (±s, n=8)

圖4 大鼠肺動(dòng)脈組織中ROS的生成量(DHE染色)Fig.4 Comparison of the generated amount of ROS in pulmonary artery tissue of rats (DHE staining)

3 討 論

DCS 是由于環(huán)境壓力驟降，導(dǎo)致血管內(nèi)外氣泡形成引起的，可發(fā)生于潛水員、宇航員等[5]。氣泡隨血液進(jìn)入肺循環(huán)時(shí)，一部分氣體通過(guò)肺毛細(xì)血管床時(shí)可逸出，未被排除的氣泡則隨血液到達(dá)左心，并隨動(dòng)脈血液分散到包括心、肺等臟器在內(nèi)的全身各部位血管中。循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)氣體的致病性，一方面是由于氣體(氣泡)栓塞血管[6]，另一方面是由于進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的大量氣體極大地改變了心腔、肺血管床成分，使心臟由血泵變?yōu)闅獗?，?dǎo)致心肌缺血、缺氧，心肌收縮無(wú)力或發(fā)生心力衰竭，從而使呼吸、循環(huán)中樞繼發(fā)缺血、缺氧[2]。不充分減壓亦可導(dǎo)致機(jī)體血管功能障礙，繼而使血液和其內(nèi)氣泡流速、流向、流態(tài)紊亂，甚至阻斷血液、氣泡流通，血液停滯，其內(nèi)氣泡呈靜止?fàn)顟B(tài)。而改善血管功能可促進(jìn)氣泡排除，一定程度減輕DCS 的發(fā)病率及死亡發(fā)生率。

國(guó)內(nèi)外對(duì)潛艇逃生、潛水等減壓過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡損傷進(jìn)行了大量的研究。Nossum等[7]經(jīng)家兔頸靜脈內(nèi)注入空氣0.01ml/(min·kg)，1h后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組家兔內(nèi)皮依賴的血管舒張能力下降，非內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管舒張能力不變，且光鏡下血管內(nèi)皮層并未出現(xiàn)異常，從而證實(shí)氣泡可導(dǎo)致內(nèi)皮層生化水平的紊亂，使內(nèi)皮依賴的血管舒張能力下降。該研究從側(cè)面驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。另外，王巖等[8]的研究中提到在潛水前5d或潛水前30min用硝酸酯類(lèi)作為外源NO供體可明顯減少大鼠和豬體內(nèi)的氣泡，降低DCS的發(fā)生率和患者死亡率，而給予非選擇性NOS抑制劑(L-NAME)則可增加DCS的發(fā)生率和死亡率。NO可介導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，因此我們推測(cè)DCS中的血管功能損傷與NO合成障礙有關(guān)。介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的NO主要由血管內(nèi)皮中的eNOS合成[9-10]。eNOS為兩個(gè)單體組成的二聚體蛋白，其在二聚體狀態(tài)下可發(fā)生下列化學(xué)反應(yīng)：L-精氨酸+O2eNOS二聚體→L-胱氨酸+NO。若eNOS解離為單體，則介導(dǎo)的反應(yīng)變?yōu)椋篖-精氨酸+O2eNOS單體→ONOO–+H2O2+O2[11]。ONOO–可使酪氨酸硝基化，改變信號(hào)通路，引起一系列細(xì)胞毒性反應(yīng)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，DCS模型中肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴的血管舒張功能較對(duì)照組明顯降低，DCS模型大鼠肺動(dòng)脈組織中存在eNOS解偶聯(lián)情況，且組織中蛋白酪氨酸硝基化水平及ROS生成明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明DCS中存在肺動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS解偶聯(lián)情況，導(dǎo)致NO合成減少，內(nèi)皮依賴的血管舒張功能降低，從而使血管閉塞加重，氣泡通過(guò)受阻，肺內(nèi)濾出氣泡減少，最后使DCS損傷加重。eNOS解偶聯(lián)后產(chǎn)生的ONOO–使蛋白酪氨酸硝基化并合成超氧離子，介導(dǎo)一系列過(guò)氧化損傷。eNOS解偶聯(lián)可能為DCS氣泡損傷中的一個(gè)靶點(diǎn)，但不是DCS中損傷的唯一靶點(diǎn)，干預(yù)該過(guò)程能否改善DCS整體發(fā)病率及死亡率還需進(jìn)一步研究。

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Effects of eNOS uncoupling on the endothelial dysfunction of pulmonary artery in rats with decompression sickness

LIN Hai-shan1, OU Min2*, FANG Yi-qun31Third Clinical Medical School of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
2Department of VIP Respiratory, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, China
3Navy Medical Research Unit, Shanghai 200433, China
*

, E-mail: oumin1999@aliyun.com
This work was supported by the Army Research Subject of Traditional Chinese Medicine (10ZYZ219)

ObjectiveTo explore the effects of unsafe decompression on the endothelial function of pulmonary artery in rat and its possible related mechanism.MethodsSixty male SD rats (260±35g) were randomly divided into two groups (30 each): control group and decompression (DCS) group. Decompression sickness (DCS) model was reproduced by placing the rats in a compression chamber with air pressure of 600kPa for 60min, followed by decompression at a rate of 100kPa/min to normal pressure. The surviving rats in both control and DCS groups were sacrificed and their pulmonary artery was harvested. The endothelium dependent vasodilatation capacity of isolated pulmonary artery was assessed. The expression and uncoupling of endothelial nitric oxide synthetase (eNOS), as well as the nitration level of each kind of protein in the pulmonary artery tissue, were analyzed by Western blotting. The concentration of reactive oxygen species (ROS) in the pulmonary artery was determined with superoxide anion probe dihematoporphyrin ether (DHE) staining.ResultsTen of 30 rats in DC group died of unsafe decompression, and the endothelium dependent vasodilatation capacity of excised pulmonary artery in survived rats was found to decline obviously (P<0.05). No significant difference was found in the expression level of eNOS between the two groups (P>0.05), but the ratio of eNOS monomer/dimer increased significantly in DC group than in control group (P<0.05). The tyrosine nitration level of each kind of protein in the pulmonary artery tissues was higher significantly in DC group than that in control group (P<0.05). DHE showed that the generated amount of DCS in pulmonary artery tissues was obviously higher in DC group than in control group (P<0.05).ConclusionsUnsafe decompression may lead to uncoupling of eNOS dimersin the endothelium of pulmonary artery. Uncoupled eNOS monomers may inhibit the synthesis of NO, thereby affect the endothelium dependent vasodilatation function. On the other hand, the eNOS monomers may facilitate the anabolism of ONOO-, leading to an increase in tyrosine nitration level of each kind of protein in the pulmonary artery tissues, thereby cause the regulation disorder of cell information system. The eNOS monomers may also increase the production of ROC, there by mediate the peroxide injuries.

decompression disease; nitric oxide synthase type Ⅲ; superoxide anion free radical O2; 3-nitrotyrosine

R845.21

A

0577-7402(2015)06-0502-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.06.17

2014-11-24；

2015-04-10)

(責(zé)任編輯：張小利)

軍隊(duì)中醫(yī)藥科研專(zhuān)項(xiàng)課題(10ZYZ219)

林海珊，碩士研究生。主要從事減壓病防治方面的研究

510515 廣州 南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(林海珊)；100048 北京 海軍總醫(yī)院干部呼吸內(nèi)科(歐敏)；200433 上海 海軍醫(yī)學(xué)研究所(方以群)

歐敏，E-mail：oumin1999@aliyun.com