響應(yīng)曲面優(yōu)化固定化微生物修復(fù)石油污染土壤

張 涵，韓雨彤，張守娟，丁 錚，張秀霞

(中國石油大學(xué) 環(huán)境與安全工程系， 山東 青島266580)

響應(yīng)曲面優(yōu)化固定化微生物修復(fù)石油污染土壤

張 涵，韓雨彤，張守娟，丁 錚，張秀霞

(中國石油大學(xué) 環(huán)境與安全工程系， 山東 青島266580)

采用秸稈載體DG吸附高效石油降解菌SJ5-1制備固定化微生物。在花盆中模擬固定化微生物修復(fù)石油污染土壤，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察wC∶wN∶wP(有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值)、含水率、接種量對(duì)石油烴降解率的影響，再通過Design-Expert 8.06響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立多元二次回歸方程預(yù)測(cè)模型，進(jìn)一步確定固定化微生物的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)組合，并在最佳參數(shù)條件下驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確；在土壤含油率為4.72%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，固定化微生物修復(fù)35 d，響應(yīng)面優(yōu)化得到固定化微生物最佳降解條件為wC∶wN∶wP=100∶9.79∶1，接種量10.34%、含水率17.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，石油烴降解率為42.4%，高于單因素最優(yōu)條件時(shí)的40.8%；對(duì)石油烴降解率影響的顯著性從大到小的因素依次是接種量、含水率、wC/wN。

固定化微生物；石油污染土壤；響應(yīng)面；優(yōu)化條件

隨著石化工業(yè)的發(fā)展，在石油勘探、開采、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過程中，由于意外事故或管理不當(dāng)，導(dǎo)致石油排放到土壤田間，使土壤環(huán)境遭受污染，直接危害人類生產(chǎn)與生活。20世紀(jì)80年代以前，土壤修復(fù)方法主要是物理法和化學(xué)法。由于難以大規(guī)模實(shí)施、對(duì)土壤結(jié)構(gòu)造成破壞、產(chǎn)生二次污染等缺陷[1]，限制了這兩種方法的應(yīng)用。20世紀(jì)80年代以來，生物修復(fù)技術(shù)因其無污染、無毒害得到了人們的重視[2]，在土壤修復(fù)領(lǐng)域中取得了很大進(jìn)步。然而，傳統(tǒng)微生物修復(fù)技術(shù)往往對(duì)多變的環(huán)境條件抵抗力弱，導(dǎo)致降解效率不高。秸稈在土壤中易被生物降解、來源廣，不僅對(duì)土壤結(jié)構(gòu)無害，而且可改善土壤理化性質(zhì)，應(yīng)用在土壤修復(fù)中是一種理想的土壤調(diào)理劑和微生物的載體[3-4]。近年來，秸稈載體[5-7]的固定化微生物在石油污染土壤修復(fù)中脫穎而出。關(guān)于固定化微生物在土壤中降解條件的優(yōu)化研究尚少，研究多集中在制備條件等方面。有學(xué)者提出修復(fù)土壤工程啟動(dòng)前，需要調(diào)節(jié)土壤條件[8-9]，以保證微生物高效修復(fù)。

響應(yīng)面法(Response surface method，RSM)是通過對(duì)響應(yīng)曲面及等高線的分析，利用多元二次回歸方程來擬合響應(yīng)值與各因素之間的函數(shù)關(guān)系[10]，依此從響應(yīng)曲面上找到最佳控制點(diǎn)，尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。與正交法相比，響應(yīng)面法可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表達(dá)方面具有較大的價(jià)值，在污染修復(fù)中的應(yīng)用[7,11]也有相關(guān)報(bào)道。

筆者采用前期篩選出的天然有機(jī)秸稈DG為載體，采用吸附法制備固定化微生物。利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化降解條件，考察各自變量及其交互作用對(duì)降解效果的影響，建立多元二次回歸方程，得出降解優(yōu)化條件，為秸稈固定化微生物在土壤修復(fù)的應(yīng)用提供技術(shù)參數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 供試土壤

供試土壤為新疆風(fēng)城油田作業(yè)區(qū)附近被石油污染的土壤。對(duì)其進(jìn)行風(fēng)干，去除粒徑大的植物殘?bào)w和砂礫，碾碎，貼標(biāo)簽，裝瓶置于4℃冰箱，備用。

1.2 供試菌種

所用菌種為實(shí)驗(yàn)前期篩選出的原油降解菌SJ5-1。菌落呈黃褐色、圓形、大小均勻、邊緣整齊，革蘭氏陰性，無芽孢，吲哚實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)均為陰性，接觸酶實(shí)驗(yàn)為陽性，初步鑒定為無色桿屬(Chromobacter)細(xì)菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定化微生物制備

取已粉碎、篩分至40目的秸稈載體DG裝入錐形瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。將其與石油高效降解菌SJ-1活化好的菌液按體積比1∶5混合，于30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。倒掉上層培養(yǎng)基，用生理鹽水將載體材料轉(zhuǎn)移到離心管中，在離心機(jī)中1000 r/min下離心5 min后，棄去上清液。重復(fù)2次，離心所得沉淀即為固定化微生物[7]。

1.3.2 固定化微生物的生物量測(cè)定

將2.0 g固定化微生物加入錐形瓶中，加入50 mL無菌水，于160 r/min培養(yǎng)0.5 h。取上層菌液1 mL以10倍為1個(gè)梯度進(jìn)行稀釋，涂布平板，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。游離菌培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量的確定亦取1 mL菌液稀釋，涂布平板計(jì)數(shù)。計(jì)算1 mL游離菌菌液與1 g固定化微生物細(xì)菌數(shù)量之間的關(guān)系。得到固定化微生物生物量為8.08×1012個(gè)/g，游離菌液細(xì)菌數(shù)量9.42×1011個(gè)/mL，等生物量換算，8.08×1012/(9.42×1011)=8.58 mL/g，即1 g固定化微生物相當(dāng)于8.58 mL游離菌菌液。

1.3.3 土壤和秸稈理化性質(zhì)測(cè)定

采用超聲-萃取紫外分光光度法[12]測(cè)定土壤石油烴含量；采用重量法測(cè)定土壤含水率；參考國家標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1377-2007，采用電極電位法(pHS-3酸度計(jì))測(cè)定土壤pH值；采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定土樣的有機(jī)質(zhì)含量；采用半微量凱氏法測(cè)定土樣的總氮含量；采用鉬銻抗比色法測(cè)定土樣的速效磷[13]。

土壤及秸稈的理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤及秸稈的理化性質(zhì)

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取wC∶wN∶wP、含水率、固定化微生物接種量3個(gè)因素。通過單因素實(shí)驗(yàn)考察各個(gè)因素對(duì)原油降解率的影響，分別確定固定化微生物降解率最好的降解條件。

(1)在4個(gè)相同花盆中分別裝500 g土樣。以摩爾比為1的硫酸銨和硝酸鈉為氮源，磷酸二氫鉀為磷源，溶于少量水中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的前期研究，調(diào)節(jié)土壤wC∶wN∶wP(有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比)為100∶2∶1、100∶5∶1、100∶10∶1、100∶20∶1，添加固定化微生物接種量10%(1 g土樣含0.1 mL游離菌)(根據(jù)等生物量換算結(jié)果，按500 g土樣含50 mL游離菌計(jì)算固定化微生物添加量)，含水率維持在20%左右[14]。每天澆水、翻耕，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 d，每7 d測(cè)定土壤石油烴含量，得出最佳wC∶wN∶wP。

(2)為了考察固定化微生物對(duì)土壤含水率的適應(yīng)范圍，設(shè)置含水率分別為8%、14%、18%、23%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的土壤，采用(1)實(shí)驗(yàn)中得出的wC∶wN∶wP，接種量10%，修復(fù)35 d，得出最佳含水率。

(3)為了避免實(shí)際應(yīng)用中降解效率不高及降解菌和載體的浪費(fèi)，實(shí)驗(yàn)確定最佳的固定化微生物接種量。分別向土壤中添加5%、10%、15%、20%的固定化微生物，采用 (1)、(2)實(shí)驗(yàn)得出的wC∶wN∶wP、含水率， 修復(fù)35 d，得出最佳接種量。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

采用響應(yīng)面優(yōu)化Box-Behnken Design(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型，按wC∶wN∶wP、含水率、接種量3個(gè)因素對(duì)修復(fù)效果的影響進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，利用回歸方程優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，確定石油烴降解率最高時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件組合。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對(duì)固定化微生物修復(fù)污染土壤石油烴降解率的影響

2.1.1wC∶wN∶wP的影響

初始含油率為4.72%的供試土壤，在不同wC∶wN∶wP條件下，固定化微生物修復(fù)35 d，石油烴降解率隨時(shí)間的變化如圖1所示。

從圖1可以看出，固定化微生物的石油烴降解率隨時(shí)間的延長而增大，補(bǔ)充氮源、磷源，降解效果明顯。wC∶wN∶wP為100∶2∶1、100∶5∶1、100∶10∶1、100∶20∶1時(shí)，在初始含油率為4.72%的土壤石油烴降解率分別為25.1%、28.1%、34.9%、26.5%。隨著N源的增加，石油烴降解率也隨之增加，wC∶wN∶wP比為100∶10∶1時(shí)降解率達(dá)到最大值；N源繼續(xù)增大，降解率反而降低，說明N源過多，會(huì)影響石油烴的降解率。

圖1 不同wC∶wN∶wP下固定化微生物修復(fù)污染土壤的石油烴降解率隨時(shí)間的變化

微生物對(duì)氮源的敏感度大[15-17]，氮源含量過低，不能滿足微生物的需要，限制了微生物活性，導(dǎo)致石油烴降解率較低；秸稈固定化微生物的加入，對(duì)土壤的N源有一定的貢獻(xiàn)值；wC∶wN∶wP為100∶20∶1，氮源過高，碳源不足，造成氮源的浪費(fèi)，不利于石油烴的降解。因此，秸稈DG固定化微生物修復(fù)石油污染土壤時(shí)應(yīng)保持營養(yǎng)物質(zhì)的平衡，才能達(dá)到高效降解的效果。

2.1.2 含水率的影響

初始含油率為4.72%的供試土壤，在不同含水率的條件下，固定化微生物修復(fù)35 d，石油烴降解率隨時(shí)間的變化如圖2所示。

從圖2可以看出，在不同含水率下，石油烴降解率隨著固定化微生物修復(fù)時(shí)間的延長呈不同程度增大。含水率在18%時(shí)，降解率最高達(dá)到38.5%；含水率23%左右時(shí)，降解率反而最低。微生物的生長繁殖離不開水，土壤含水率過低，土壤中微生物不活動(dòng)，達(dá)不到生長的需求，微生物的呼吸作用減弱，影響對(duì)石油烴的降解[18]；土壤含水率適宜，水分子在土粒周圍形成水膜，切斷或阻礙了石油烴與土壤顆粒間的聯(lián)系、吸附，同時(shí)微生物可以進(jìn)入水膜內(nèi)，增加了與石油的接觸機(jī)會(huì)，使微生物得以繁殖，能夠在油水界面活躍生長，可高效降解石油烴。23%左右時(shí)，實(shí)驗(yàn)中觀察到土壤已經(jīng)成泥漿的狀態(tài)，妨礙 O2的擴(kuò)散，使好氧微生物缺氧而死亡，導(dǎo)致降解率較低[19]，僅為26.3%，與含水率為14%時(shí)的降解率28.4%相差不大。說明固定化微生物修復(fù)石油污染土壤時(shí)適宜的含水率應(yīng)該維持在14%～23%之間，最好是18%左右。

圖2 不同含水率下固定化微生物修復(fù)污染土壤的石油烴降解率隨時(shí)間的變化

保持土壤適宜的水分有利于改善修復(fù)效果，特別是干旱或半干旱地區(qū)需要適時(shí)適量的補(bǔ)充水分，才能維持固定化微生物對(duì)石油烴的高效降解。

2.1.3 固定化微生物接種量的影響

初始含油率為4.72%的供試土壤，在不同接種量下，固定化微生物修復(fù)35 d，石油烴降解率隨時(shí)間的變化如圖3所示。

土壤中微生物是石油烴降解的動(dòng)力與主體。從圖3可以看出，不同微生物接種量的土壤中石油烴降解率變化規(guī)律基本一致，隨著降解時(shí)間的延長，石油烴降解率也增加。修復(fù)35d，接種量為5%、10%、15%、20%的石油烴降解率分別為23.3%、39.4%、34.7%、26.4%，10%接種量的降解率最高。說明在一定范圍內(nèi)，接種量增多會(huì)提高降解率，超過此范圍，接種量增多反而不利于石油烴的降解。

接種固定化微生物能夠提高土壤的微生物數(shù)量，提高外接的石油降解菌與土著菌的競(jìng)爭能力，使石油降解菌迅速適應(yīng)環(huán)境，大量繁殖，發(fā)揮高效降解能力[20]。接種量與石油烴降解率并不是呈單一的正比例關(guān)系，當(dāng)接種量過多，土壤營養(yǎng)物質(zhì)不足，造成高效降解菌之間存在空間、營養(yǎng)上的競(jìng)爭，導(dǎo)致降解率降低；另外，降解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能會(huì)降低微生物與石油烴的接觸，也導(dǎo)致降解率降低。接種量過低，微生物數(shù)量與土著菌的競(jìng)爭力不強(qiáng)，接入土壤中會(huì)有一部分微生物因?yàn)椴贿m應(yīng)而死亡，導(dǎo)致降解率很低，所以適宜的接種量對(duì)石油污染土壤修復(fù)具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳固定化微生物接種量為10%。

圖3 不同接種量下固定化微生物修復(fù)污染土壤的石油烴降解率隨時(shí)間的變化

在wC∶wN∶wP為100∶10∶1、含水率18%、接種量為10%的最佳條件下，固定化微生物修復(fù)35 d后，石油烴降解率達(dá)40.8%。

2.2 固定化微生物降解條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果,以wC/wN、含水率、接種量分別為自變量A、B、C，以35 d石油烴降解率為響應(yīng)值Y，進(jìn)行17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表如表2所示。

表2 固定化微生物降解條件的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

向17個(gè)相同的花盆中分別加入0.5 kg供試土壤，按照表3的實(shí)驗(yàn)安排，于30℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)35 d。每天加水翻耕，保持充足的空氣和水分，35 d后取土樣測(cè)含油率，得出石油烴降解率。響應(yīng)曲面各系數(shù)方差分析表列于表3。

當(dāng)模型的模型顯著系數(shù)“Prob>F”值小于0.05時(shí)，表示該項(xiàng)指標(biāo)影響顯著；小于0.01時(shí)，表示該項(xiàng)指標(biāo)影響非常顯著。失擬項(xiàng)表示模型的誤差，失擬項(xiàng)系數(shù)為0.0937，大于0.05，表示模型在誤差范圍之內(nèi)。

表3 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的二次響應(yīng)面模型和方差分析

從表3可以看出，該模型的模型顯著系數(shù)為<0.0001，表示非常顯著；該模型的R2=0.9979，說明該模型的擬合度較好，精確度較高，可以用來分析和預(yù)測(cè)結(jié)果。從表3還看出，各一次項(xiàng)系數(shù)和二次項(xiàng)系數(shù)A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的影響非常顯著(“Prob>F” 值 小于0.01)，但是BC不顯著(“Prob>F”值為0.2459，大于0.05)。對(duì)石油烴降解率影響的顯著性從大到小依次是接種量、含水率、wC/wN。

以固定化微生物35d石油烴降解率為響應(yīng)值，利用軟件Design expert 8.06對(duì)Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系可用二次多元回歸方程表示，如式(1)所示。

Y=41.7+0.65A-0.87B+1.09C+0.96AB+

1.49AC-0.35BC-8.22A2-7.90B2-8.57C2

R2=0.9979(1)

式(1)中，Y為石油降解率的預(yù)測(cè)值，A、B、C分別是土壤的wC/wN、含水率以及固定化微生物接種量。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

根據(jù)等高線和三維圖可以分析固定化微生物對(duì)石油污染土壤的石油烴降解率與各因素關(guān)系，并能夠看出各因素存在的交互作用及最佳的降解條件，如圖4所示。

從圖4(a)可看出，隨著wC/wN增大，固定化微生物對(duì)石油污染土壤的石油降解率先緩慢后快速增大，超過一定比值后快速減小，wC/wN為10左右時(shí)降解率最大；隨含水率增大，石油降解率先快速增大后快速減小，含水率18%左右時(shí)降解率最大。

從圖4(b)看出，隨著wC/wN增大，固定化微生物對(duì)石油污染土壤的石油烴降解率緩慢增大后減小；隨接種量增大，降解率先增大后減小。結(jié)合表4的方差分析，接種量對(duì)石油降解率的影響最大，如果在wC/wN充足時(shí)，適當(dāng)添加外源菌有助于提高降解率。接種量在10%左右降解率最大。

從圖4(c)看出，隨著含水率增大，固定化微生物對(duì)石油污染土壤的石油烴降解率緩慢增大后減??；隨接種量增大，降解率快速增大后減小，說明接種量對(duì)降解率的影響最大。如果在土壤水分充足條件下，接入外源菌能提高降解率。

圖4 wC/wN和含水率、 wC/wN和接種量、含水率和接種量對(duì)污染土壤石油烴降解率相互作用的響應(yīng)面

由此可見，wC/wN、含水率、接種量不是越大越利于石油烴的降解，它們對(duì)降解率的影響作用不同；3個(gè)因素存在顯著的相互作用，存在最佳的組合，使得降解率達(dá)到最高。將二次多元回歸方程求導(dǎo)，取降解率極大值點(diǎn)時(shí)的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)，得到wC/wN=10.21、含水率17.8%、接種量10.34%，此時(shí)石油烴降解率的理論值達(dá)41.8%。

2.2.3 響應(yīng)曲面模型驗(yàn)證

為了對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行花盆模擬實(shí)驗(yàn)，于30℃的培養(yǎng)箱中修復(fù)35 d，得到石油烴降解率42.4%，與模型結(jié)果41.8%較接近，說明響應(yīng)面優(yōu)化法模型能很好地預(yù)測(cè)石油污染土壤的修復(fù)效果，比單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳組合條件下的降解率大，但是相差不大。

3 結(jié) 論

(1)單因素實(shí)驗(yàn)得出，固定化微生物修復(fù)石油污染土壤的最佳條件為wC∶wN∶wP=100∶10∶1，含水率18%、接種量10%。任何一種因素過大或過小都會(huì)對(duì)石油烴降解不利。

(2)根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立了wC/wN、含水率、接種量與固定化微生物修復(fù)石油污染土壤的石油烴降解率之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，該模型為Y=41.7+0.65A-0.87B+1.09C+0.96AB+1.49AC-0.35BC-8.22A2-7.90B2-8.57C2，R2=0.9979，模型回歸效果顯著。

(3)在含油率為4.72%時(shí)，響應(yīng)面優(yōu)化得到的固定化微生物修復(fù)石油污染土壤的最佳條件為wC∶wN∶wP=100∶9.79∶1，接種量10.34%、含水率17.8%。在此條件下，修復(fù)35 d得到的石油烴降解率為42.4%，比單因素實(shí)驗(yàn)得出的最佳組合條件下的結(jié)果高1.6%。對(duì)石油烴降解率影響的顯著性從大到小的因素依次是接種量、含水率、wC/wN。

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Optimization for Petroleum-Contaminated Soil Remediated by Immobilized Microorganisms Using Response Surface Method

ZHANG Han，HAN Yutong，ZHANG Shoujuan，DING Zheng，ZHANG Xiuxia

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)

Straw DG was used as carrier material for petroleum hydrocarbon degrading strain SJ5-1 to prepare immobilized microorganisms. In indoor flowerpot, the remediation of petroleum-contaminated soil by immobilized microorganisms was simulated, and the impacts ofwC∶wN∶wP, moisture content and the inoculum amount on hydrocarbon degradation rate were investigated by single factor experiment. Then the response surface method was used to design the experiment, by which a prediction model of quadratic polynomial regression equation was obtained to determine the optimal parameter arrangement. Under the optimized parameter arrangement, the model was verified. The results indicated that the model was proved veracious. By controlling the immobilized microorganisms inoculum being 10.34%,wC/wN=10.21, moisture content being 17.8% according to response surface analysis, the best degradation rate of 42.4% was obtained, which was higher than the best result of 40.8% obtained under the optimal conditions based on single factor experiment. The significance order of influence on hydrocarbon degradation rate from high to low was the inoculum amount, moisture content,wC/wN.

immobilized microorganisms; petroleum-contaminated soil; response surface method; optimum condition

2014-03-03

山東省自然科學(xué)基金(ZR2014BM023)、中國石油科技創(chuàng)新基金(2009D-5006-07-01)、青島市科技發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(KJZD-12-65-jch)、中央直屬高校科研專項(xiàng)基金(11CX05011A)、中國石油大學(xué)(華東)研究生創(chuàng)新工程(CX-1219)和(CX2013035)資助

張涵，女，碩士，主要研究石油污染土壤修復(fù)；E-mail:zhanghan 199101@163.com

張秀霞，女，教授，博士，主要從事石油污染土壤修復(fù)研究 ；E-mail:zhxiuxia@upc.edu.cn

1001-8719(2015)04-1028-07

X53

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.04.029