超表達擬南芥2－烯醛還原酶基因?qū)煵菘购敌缘淖饔脵C理分析

吳 茜，王仕穩(wěn)，曹 丹，陳道鉗，張梅娟，鄧西平，殷俐娜＊

（1中國科學(xué)院水利部水土保持研究所，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，陜西楊陵712100；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，陜西楊陵712100；4西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵712100）

超表達擬南芥2－烯醛還原酶基因?qū)煵菘购敌缘淖饔脵C理分析

吳 茜1，2，王仕穩(wěn)1，3，曹 丹1，2，陳道鉗4，張梅娟4，鄧西平1，3，殷俐娜1，3＊

（1中國科學(xué)院水利部水土保持研究所，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，陜西楊陵712100；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，陜西楊陵712100；4西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵712100）

為研究是否可以利用2－烯醛還原酶（AER）來清除活性氧下游的醛自由基達到提高植物的抗旱性，以超表達擬南芥AER基因煙草和野生型煙草（SR）為研究材料，利用干旱脅迫處理進行抗旱性分析，測定了干旱脅迫及復(fù)水后各個煙草株系的生物量、光合速率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量、MDA和H2O2含量等指標(biāo)。結(jié)果顯示：（1）干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草株系的生物量、葉綠素含量、凈光合速率、PSⅡ最大光化學(xué)效率及H2O2的清除能力均顯著高于對照；（2）復(fù)水之后，煙草植株的各項生理指標(biāo)都得到一定程度的恢復(fù)，而轉(zhuǎn)基因株系相比于野生型恢復(fù)迅速，恢復(fù)能力更強。研究認(rèn)為，超表達AER基因可以通過清除活性氧及其下游醛自由基來提高煙草的抗旱能力。

抗旱性；2－烯醛還原酶（AER）；干旱脅迫；煙草；生理指標(biāo)

隨著近年來全球氣候變暖，旱災(zāi)出現(xiàn)的頻率和

程度都在增加，造成作物的大面積減產(chǎn)［1］。為保障人類的糧食安全，提高作物的抗旱能力是在未來極端氣候多發(fā)的情況下提高作物產(chǎn)量的重要手段，而了解植物的抗旱機理是提高作物抗旱能力的基礎(chǔ)。干旱對植物造成傷害的原因之一是造成植物體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量積累，從而引起植物的氧化傷害［2－4］。在植物細胞中，ROS的產(chǎn)生主要來源于線粒體、葉綠體和過氧化物體。在干旱條件下，植物體內(nèi)呼吸鏈中的電子傳遞受阻、光合作用中與卡爾文循環(huán)相關(guān)酶類活性的降低等，均可造成ROS的大量積累。這些性質(zhì)活潑的ROS一方面可通過直接修飾DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及碳水化合物等，給細胞造成傷害，甚至引起細胞死亡［56］。另一方面，ROS中的單線態(tài)氧和羥基自由基極易攻擊細胞膜重要組分多聚不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids），產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，脂質(zhì)自由基與O2進行耦合，進而產(chǎn)生更活躍的脂質(zhì)過氧化自由基，其再攻擊多聚不飽和脂肪酸，繼而引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生大量的醛［7］。醛是一種在ROS下游所產(chǎn)生的、比ROS具有更強攻擊力的一類物質(zhì)，能夠使膜的完整性遭到破壞，并造成細胞毒害。

有研究證明環(huán)境逆境可以引起和加劇植物體內(nèi)醛的積累，而醛的過量積累也是逆境脅迫引起植物傷害的重要原因之一［8－10］。累積的活性醛類物質(zhì)不僅性質(zhì)活潑，壽命較長，而且非常容易擴散，可以與距它們生成部位較遠處的蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生反應(yīng)［1112］。在植物中，越來越多的研究證明醛參與了各種生物和非生物逆境下的毒害作用，并成為限制植物生長的重要因素之一。例如在干旱、鹽害、高溫、氧化脅迫以及重金屬毒害等逆境條件下，均可造成丙二醛（MDA）在植物體內(nèi)的大量累積［9，13－16］。MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，其在醛類物質(zhì)中毒性相對較低。近年，Yin等［10］和Mano等［8］的研究更有力地證明了活性醛基是造成植物鋁毒害和強光傷害的直接原因之一，并且清除植物體內(nèi)過量的醛可以提高植物抵抗上述逆境脅迫的能力。因此，有效清除過多的醛對維持生物體的正常生理功能至關(guān)重要。

隨著人們對植物抗逆過程更深入的了解，近幾年有關(guān)醛還原酶對提高植物抗逆性的貢獻也逐漸被重視，對植物中醛脫氫酶的研究也逐漸增多。醛脫氫酶被認(rèn)為是生物體內(nèi)活性醛類物質(zhì)清除過程中的重要酶類，能夠清除活性醛并降低其對植物體造成的傷害。醛脫氫酶催化醛類物質(zhì)氧化生成羧酸，清除有毒的醛類并減少脂類的過氧化反應(yīng)，對提高植物抗干旱、抗鹽堿和清除活性氧等能力具有重要作用。張海玲等［17］通過轉(zhuǎn)乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）基因番茄的抗逆研究表明，在干旱、高鹽和低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株較對照株的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均有所降低，轉(zhuǎn)入番茄的乙醛脫氫酶基因表達后，可將逆境下誘發(fā)膜脂過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的有毒醛類物質(zhì)分解為無毒羧酸，從而降低了活性醛類物質(zhì)對植物體造成的氧化脅迫，維持了細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性；Chen等［18］發(fā)現(xiàn)，甜菜堿乙醛脫氫酶（BADH）能夠?qū)⑻鸩藟A醛氧化成對生物體起滲透保護作用的細胞相溶性物質(zhì)甜菜堿，使細胞在干旱和高鹽等逆境脅迫下維持滲透平衡，增強植物的抗逆性。

在脂質(zhì)氧化過程中經(jīng)常產(chǎn)生一類含有α，β－不飽和雙鍵的2－烯醛，由于2－烯醛上α位的碳原子具有較高的親電性，可通過邁克爾（Michael）加成與細胞內(nèi)的巰基物質(zhì)或氨基基團發(fā)生反應(yīng)，從而破壞細胞的代謝平衡，引起細胞毒害甚至造成細胞死亡［8］。1995年，Babiychuk等首次從擬南芥中克隆了ξ－晶體（ZCr）P1基因，并在酵母中證明了該基因?qū)Χ谆柞０罚╠iamine）產(chǎn)生的氧化傷害有抗性。隨后，Mano等［8，19］證實P1－ZCr蛋白對4－羥基－2－壬烯醛（4－h(huán)ydroxy－2E－nonenal，HNE）等含有α，β－不飽和雙鍵的烯醛以及環(huán)氧乙烯具有特異的專一性。根據(jù)P1－ZCr蛋白具有的這種專一性反應(yīng)，國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)協(xié)會將此酶統(tǒng)一命名為2－烯醛還原酶（2－alkenal reductase，AER）。目前在植物中只有來自擬南芥的At－AER蛋白被鑒定具有AER的活性，其可以催化烯醛基中不飽和雙鍵的加氫還原，生成飽和的醛，然后再由其它的醛還原酶作用生成二氧化碳和水，從而極大地減少這些高活性的不飽和雙鍵與細胞內(nèi)小分子物質(zhì)的反應(yīng)。Yin等［10］利用AER對烯醛基的專一性，并對鋁脅迫下產(chǎn)生的醛種類進行了鑒定，同時證明醛獨立參與了鋁的細胞毒害作用，而轉(zhuǎn)基因煙草的高抗鋁性來自其對醛的有效特異性清除能力，該轉(zhuǎn)基因煙草還表現(xiàn)出抗強光傷害的能力［8］。但是關(guān)于AER在植物抗旱中的功能和機理的研究目前還是空白。

本研究利用超表達擬南芥AER基因的煙草植株，通過比較轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的抗性，探索AER是否可以提高植物的抗旱性，明確AER在植物抗旱中的生理生化作用，驗證是否可以通過清除活性氧下游的醛自由基來提高植物的抗旱能力，以期為提高作物抗旱性提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)和處理

所選植物材料為野生型煙草SR和2個超表達擬南芥AER基因的煙草株系A(chǔ)ER14和AER18（利用相同的表達載體轉(zhuǎn)化煙草后獲得的不同株系）。基因克隆、轉(zhuǎn)基因植物的培育及檢測見文獻［10］。

煙草種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉滅菌20 min后置于4℃冰箱春化，2d后播種于MS培養(yǎng)基上。25℃培養(yǎng)20d后獲得無菌苗，移種在裝有0.5 kg育苗基質(zhì)（有機質(zhì)≥25%，腐植酸≥10%，N＋P2O5＋K2O≥2.0%，pH 5.8～7.0）的花盆中。每個品種40盆，光照周期為16h光照／8h黑暗，20d后間苗，每盆剩1株長勢一致的幼苗進行干旱處理。通過控制澆水進行自然干旱，并每天稱重補水維持各盆之間土壤含水量水平一致。當(dāng)野生型煙草SR最新展開葉嚴(yán)重萎蔫時（第10天）進行復(fù)水處理。分別于干旱處理前、干旱處理10d和復(fù)水4d后采樣進行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 生物量 取各個株系煙草植株的地上部分，裝入信封中，稱取鮮重，在105℃殺青30min后，于80℃下烘至恒重，稱取干重，并計算植株含水量。

1.2.2 葉片含水量 剪取新鮮完全展開葉0.5g左右，稱取鮮重（FW），80℃下烘至恒重，稱取干重（DW），計算煙草葉片含水量［（FW－DW）／FW×100%］。

1.2.3 氣體交換參數(shù) 凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）及蒸騰速率（Tr）用Li－6400光合儀（Li－COR Inc.，NE，USA）測定。選取最新1片完全展開葉，LED光量子設(shè)為500μm·m－2·s－1，外界CO2濃度約為360μmol·mol－1，氣流速度設(shè)定為500 mmol·s－1，溫度維持在25℃。于處理期間每天9：00～11：00進行測定，每處理測定6次。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 煙草暗適應(yīng)30min之后，選取最新1片完全展開葉用熒光儀（Imaging－PAM，WALZ，德國）測定熒光參數(shù)。每個株系測定3～4個重復(fù)。按照公式計算出PSⅡ光化學(xué)最大量子效率Fv／Fm、實際光合量子產(chǎn)量YⅡ和相對電子傳遞速率ETR。具體公式如下：

式中，F(xiàn)m為葉片最大熒光值，F(xiàn)0為固定熒光值，F(xiàn)m′為光下執(zhí)行飽和脈沖當(dāng)PSⅡ反應(yīng)中心都處于關(guān)閉狀態(tài)時的最大熒光產(chǎn)量，F(xiàn)′為執(zhí)行飽和脈沖前的實時熒光產(chǎn)量，PAR為光合有效輻射，ETR－Factor為吸光系數(shù)，PPS2／PPPS為PSⅡ光合色素吸收的光量子占總光合色素吸收的光量子的比例。

1.2.5 葉綠素含量 選取最上部2片完全展開葉0.5g，采用80%的丙酮溶液提取法測定［20］。

1.2.6 H2O2含量 選取最上部2片完全展開葉0.5g鮮樣用液氮冷凍，然后在預(yù)冷的研缽中加入2 mL 0.1%（W／V）的TCA進行研磨。勻漿在12 000 g、4℃離心30min。取0.4mL上清液加入0.4mL 10mmol／L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）和0.8mL 1 mol／L的碘化鉀，測定390nm波長下的吸光值變化，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出H2O2含量［10］。

1.2.7 MDA含量 取0.5g最上部完全展開葉鮮樣放入冰浴的研缽中，加入少許石英砂和0.05 mol／L磷酸緩沖液（pH 7.0），研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移到試管中，再用2～3mL 0.05mol／L磷酸緩沖液分2次沖洗研缽，合并提取液并在5 000g下離心10min。取2mL上清液加入5mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液搖勻。將試管放入沸水中煮沸10min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計時）。到時間后立即將試管取出并放入冷水浴中。待試管內(nèi)溶液冷卻后，再于3 000g離心15min，取上清液，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白測532nm、600nm和450 nm處的吸光度A532、A600和A450，然后根據(jù)以下公式計算MDA含量：

式中，Vt為提取液總體積（mL）；Vs為測定用提取液體積（mL）；FW為樣品鮮重（g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件中的鄧肯氏多重比較法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性水平設(shè)定為α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對煙草生物量和葉片含水量的影響

生物量是衡量植物抗旱的一個重要指標(biāo)。如圖1，A所示，正常水分條件下，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER14生長較慢，其生物量顯著低于野生型煙草；干旱脅迫處理10d后，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER14的生物量無明顯差異，而轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER18的生物量顯著高于野生型；復(fù)水4d后，野生型煙草的生物量是干旱處理前的2.74倍，轉(zhuǎn)基因煙草株系A(chǔ)ER14和AER18的生物量分別是處理前的5.26和4.34倍，轉(zhuǎn)基因株系和對照之間的生物量差異顯著。說明在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的生長速度明顯高于野生型。

干旱處理前，各煙草株系的土壤水分均呈飽和狀態(tài)，其葉片絕對含水量之間也無差異。干旱脅迫10d后，各株系葉片含水量均顯著降低；復(fù)水4d后，各處理煙草的葉片含水量均略微升高，但仍顯著低于干旱脅迫前，且各株系之間也無顯著差異，即各時期株系間葉片含水量均無顯著差異（圖1，B）。

2.2 干旱脅迫下煙草的光合氣體交換參數(shù)的變化

干旱脅迫下煙草凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）如圖2所示。在干旱處理前，轉(zhuǎn)基因株系和野生型煙草的凈光合速率無顯著差異。隨著干旱時間的延長，轉(zhuǎn)基因株系和對照的凈光合速率都顯著降低；在干旱脅迫10d后，野生型煙草的凈光合速率降低到0.5μmol·m－2·s－1，而轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率約為1μmol·m－2·s－1，是野生型煙草的2倍。復(fù)水后，煙草凈光合速率快速升高，而轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率顯著高于野生型（圖2，A）。

圖1 干旱脅迫下野生型煙草（SR）和轉(zhuǎn)AER基因煙草株系（AER14、AER18）的生物量和葉片絕對含水量Ⅰ.處理前；Ⅱ.干旱脅迫后；Ⅲ.復(fù)水后；同期不同字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異；下同F(xiàn)ig.1 Biomass and leaf water content of wild－type plant（SR）and transgenic plant（AER14，AER18）under drought stressⅠ.Before treatment；Ⅱ.After drought stress；Ⅲ.After rehydration；The different normal letters in the same stage indicate significant difference among treatments at 0.05level；The same as below

圖2 干旱脅迫下野生型煙草SR和轉(zhuǎn)AER基因煙草株系（AER14、AER18）的光合參數(shù)Fig.2 Photosynthetic parameters of wild－type plant（SR）and transgenic plant（AER14，AER18）during drought stress

煙草蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度的變化趨勢與凈光合速率基本一致，干旱處理前轉(zhuǎn)基因株系與野生型無顯著性差異（圖2，B和2，C）。隨著土壤含水量的降低，干旱脅迫時間的增加，蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均緩慢降低，在干旱脅迫第6天，各煙草株系的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均降低，但轉(zhuǎn)基因株系高于野生型。到干旱第10天，野生型煙草的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度分別為0.25mmol·m－2·s－1和0.005 8mol·m－2·s－1，而轉(zhuǎn)基因株系則相近，分別約為0.43mmol ·m－2·s－1和0.01mol·m－2·s－1，約是野生型煙草的2倍。復(fù)水后，煙草的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度快速恢復(fù)，但轉(zhuǎn)基因株系比野生型恢復(fù)得迅速，其蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均顯著高于野生型。抗旱性強的植株在水分脅迫下能夠保持高的光合速率［21］。說明超表達AER基因煙草具有良好的抗旱能力。

2.3 干旱脅迫下煙草葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是一組用于描述植物光合作用機理和光合生理狀況的變量，是間接評價光合活性的一種方法。Fv／Fm表示當(dāng)所有反應(yīng)中心開放時PSⅡ的最大光化學(xué)效率，可以衡量PSⅡ的光抑制程度［22］。如圖3，A所示，在干旱處理前，各個株系的PSⅡ最大光化學(xué)效率之間無明顯差異；干旱脅迫10d后，各株系Fv／Fm值均顯著降低，野生型煙草的降低幅度為5.1%，而轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER14和AER18分別降低了2.7%和3.9%，轉(zhuǎn)基因株系的降低幅度要顯著小于野生型；復(fù)水4d后，轉(zhuǎn)基因株系和對照的Fv／Fm值均迅速恢復(fù)，但其間沒有顯著差異。說明在干旱脅迫條件下，超表達AER基因有效減輕了煙草葉片PSⅡ受到的逆境傷害。

同時，干旱處理前，轉(zhuǎn)基因株系和野生型之間的實際光合量子產(chǎn)量YⅡ沒有顯著差異（圖3，B）；干旱脅迫10d后，各個株系的YⅡ均大幅顯著降低，野生型煙草降低為處理前的72.9%，轉(zhuǎn)基因株系分別降低為處理前的87.0%和70.7%。但轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER14的YⅡ高于野生型，并呈顯著性差異；復(fù)水4d后，各煙草株系的實際光合量子產(chǎn)量均快速恢復(fù)，且轉(zhuǎn)基因株系與對照之間有明顯差異，尤其是轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER18顯著高于野生型煙草。

另外，正常條件下轉(zhuǎn)基因株系和野生型之間的相對電子傳遞速率ETR無明顯差異。干旱脅迫10d后，野生型煙草ETR大幅顯著降低，而轉(zhuǎn)基因株系的降低幅度相對較小，其值與野生型對照之間差異顯著；復(fù)水4d后，各煙草株系ETR均迅速恢復(fù)，但轉(zhuǎn)基因株系ETR顯著高于野生型（圖3，C）。

圖3 干旱脅迫下野生型煙草SR和轉(zhuǎn)AER基因煙草株系（AER14、AER18）的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.3 Chlorophyll fluorescence parameters of wild－type plant（SR）and transgenic plant（AER14，AER18）under drought stress

圖4 干旱脅迫下野生型煙草SR和轉(zhuǎn)AER基因煙草株系（AER14、AER18）的葉綠素含量Fig.4 Content of chlorophyll of wild－type plant（SR）and transgenic plant（AER14，AER18）under drought stress

2.4 干旱脅迫下煙草葉綠素含量的變化

圖4顯示，干旱處理之前，轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的葉綠素含量無顯著差異；干旱脅迫10d后，野生型煙草葉綠素含量降至9.77mg·g－1，而轉(zhuǎn)基因株系分別為14.52和12.84mg·g－1，比脅迫前均大幅降低，但轉(zhuǎn)基因株系遠高于野生型煙草；復(fù)水4d后，各株系煙草葉綠素含量均有所升高，但仍遠低于干旱脅迫前水平，而轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫和復(fù)水后都能維持較高的葉綠素含量。表明干旱脅迫使非轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素降解嚴(yán)重，而轉(zhuǎn)基因煙草仍能維持較高的葉綠素含量。

2.5 干旱脅迫下煙草MDA和H2O2含量的變化

MDA含量是衡量逆境對植物傷害程度的重要指標(biāo)。圖5，A顯示，干旱處理前，轉(zhuǎn)基因株系與野生型煙草的MDA含量無明顯差異；干旱脅迫處理10d后，各煙草株系的MDA含量均升高約2倍，而轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER18顯著低于野生型；復(fù)水4d后，煙草MDA含量降低，且轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER14和AER18的MDA含量顯著低于野生型煙草。

正常生長條件下轉(zhuǎn)基因株系與對照的H2O2含量無明顯差異；干旱脅迫10d后，各煙草株系H2O2含量均顯著升高，野生型煙草的H2O2含量為1.628μmol·g－1，而轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)ER14和AER18分別為1.133和1.270μmol·g－1，顯著低于野生型；復(fù)水4d后，各株系煙草H2O2含量均明顯降低，但轉(zhuǎn)基因株系的H2O2含量顯著低于野生型煙草（圖5，B）。說明轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫條件下能通過減少H2O2積累量來減輕逆境脅迫造成的傷害，從而提高耐旱性。

圖5 干旱脅迫下野生型煙草SR和轉(zhuǎn)AER基因煙草株系（AER14、AER18）的MDA和H2O2含量Fig.5 Contents of MDA and H2O2of wild－type plant（SR）and transgenic plant（AER14，AER18）under drought stress

3 討 論

當(dāng)植物處于逆境脅迫環(huán)境中時，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列生理生化變化來減輕逆境對細胞的傷害［5］。土壤水分虧缺會使植物葉綠素蛋白質(zhì)的合成受到抑制，葉綠素逐漸分解，光合色素含量下降，植物光合能力受抑制。因此，葉綠素的破壞程度可以作為植物在干旱脅迫下組織受損程度的判定標(biāo)準(zhǔn)之一［23］。正常情況下，植物體內(nèi)活性氧如過氧化氫、羥自由基等的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，不會對細胞造成傷害。但是在鹽、干旱或病害脅迫下，ROS在植物體內(nèi)過量積累，與各種大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)等受到傷害，使細胞膜脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，破壞生物膜的流動性、通透性和完整性，導(dǎo)致細胞膜透性增大、細胞液外滲，進一步導(dǎo)致細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的破壞及誘發(fā)細胞程序性死亡［24］。一般認(rèn)為，在逆境脅迫下清除體內(nèi)自由基能力較強的植物，抗逆能力愈強。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物之一，它的積累水平反映細胞受傷害的程度，MDA的含量與植物抗逆性呈負(fù)相關(guān)。因此，葉綠素含量的變化和MDA的累積程度可以作為衡量植物抗旱性的重要指標(biāo)。

干旱脅迫10d后，本研究野生型的生物量顯著低于轉(zhuǎn)基因株系，說明轉(zhuǎn)AER基因提高了煙草的抗旱能力。同時，干旱處理后各煙草株系的光合速率、葉綠素含量和Fv／Fm等都有所下降，但轉(zhuǎn)基因煙草的下降幅度和速度明顯小于野生型對照。復(fù)水4d后，各項指標(biāo)均迅速恢復(fù)，而轉(zhuǎn)基因煙草仍高于對照，尤其是轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量顯著高于對照，說明轉(zhuǎn)基因煙草葉片中葉綠體膜的受損程度小于野生型植株。另外，干旱脅迫10d及復(fù)水4d后，野生型煙草的H2O2含量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系。干旱脅迫首先傷害的是原生質(zhì)膜［25］，而MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物［26］。MDA含量會隨著干旱脅迫處理時間的延長而增加，與干旱脅迫強度呈正比關(guān)系［27］。本實驗中干旱脅迫10d后各煙草株系的MDA含量顯著升高，復(fù)水后又降低，而轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量低于野生型煙草。表明在干旱脅迫條件下，超表達AER基因減少了膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累量，減輕了細胞的膜脂過氧化傷害，維持了細胞相對較強的生理功能。由此說明在干旱脅迫下轉(zhuǎn)AER基因煙草的抗旱性高于野生型煙草。

本研究表明超表達AER基因可能在旱后復(fù)水、促進植物恢復(fù)的過程中起著更重要的作用。在干旱脅迫下，本研究中AER18的實際光合量子產(chǎn)量YⅡ與野生型煙草無顯著差異，但復(fù)水后，AER18的YⅡ迅速恢復(fù)，表明超表達AER使植株能夠更快地修復(fù)脅迫下受損的光系統(tǒng)，從而使AER18在復(fù)水后表現(xiàn)出更高的YⅡ及ETR。超表達AER基因在復(fù)水后促進植物恢復(fù)的作用還表現(xiàn)在生物量和光合差異方面，復(fù)水后轉(zhuǎn)基因株系與野生型的生物量、光合參數(shù)差異比在干旱脅迫過程中的更顯著。

另外，從結(jié)果中可以看出，2個轉(zhuǎn)基因株系均顯著提高了干旱脅迫過程中和復(fù)水后的生物量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉綠素含量；顯著降低了H2O2含量和MDA的積累。但是AER14株系的表現(xiàn)要明顯優(yōu)于AER18株系，可能是由于2個株系中AER基因插入位點和插入拷貝數(shù)量不同，導(dǎo)致AER基因的表達量不同，進而引起2個轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)差異。

綜合所述，在煙草中超表達AER基因后，在干旱脅迫及復(fù)水的過程中可減輕細胞膜脂過氧化和MDA的累積，使得植物可以維持較高的光合能力和葉綠素含量，從而提高植株對干旱的耐受能力。由此可見，超表達AER基因可以通過清除醛積累來提高植物的抗旱性，即通過清除活性氧下游的醛自由基，可以有效提高植物的抗旱能力。

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（編輯：裴阿衛(wèi)）

Influence of Overexpression of 2－alkenal Reductase Gene on Drought Resistance in Tobacco

WU Xi1，2，WANG Shiwen1，3，CAO Dan1，2，CHEN Daoqian4，ZHANG Meijuan4，DENG Xiping1，3，YIN Lina1，3＊
（1State Key Laboratory of Soil Erosion and Dryland Farming on the Loess Plateau，Institute of Soil and Water Conservation，Chinese Academy of Sciences，and Ministry of Water Resources，Yangling，Shaanxi 712100，China；2University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China；3Institute of Soil and Water Conservation，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China；4College of Life Sciences，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）

In this study，we investigated the functions of 2－alkenal reductase（AER）in improving drought tolerance.Transgenic tobacco plants overexpressing 2－alkenal reductase and wild－type tobacco plants（SR）were used to measure the biomass，photosynthetic rate，chlorophyll fluorescence parameters，contents of chlorophyll，MDA and H2O2under drought stress and rehydration.Results showed that：（1）the biomass，content of chlorophyll，photosynthetic rate，chlorophyll fluorescence parameters and the capability for scavenging H2O2of the transgenic tobacco plants were significantly higher than those of control plants under drought treatment.（2）After rehydration，the physiological indexes of tobacco recovered.The recovery capability of transgenic lines is better than that of wild－type.These results indicated that overexpression of AER gene lead to enhanced drought tolerance in transgenic tobacco plants.

drought tolerance；2－alkenal reductase（AER）；drought stress；tobacco；physiological indexes

Q789

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1166

1000－4025（2015）06－1166－07

2014－12－07；修改稿收到日期：2015－05－24

國家自然科學(xué)基金（31200206）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（ZD2012023）

吳 茜（1989－），女，在讀碩士研究生，主要從事植物抗逆生理研究。E－mail：wuxi0420＠126.com

＊通信作者：殷俐娜，副研究員，從事植物抗逆生理及分子機制方面的研究。E－mail：linayin＠nwsuaf.edu.cn