基于cpDNA和rDNAITS片段分析西南地區(qū)青楊派楊樹(shù)的系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系

李佳蔓，員 濤，周安佩，縱 丹，李 旦，何承忠，4＊

（1云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224；2西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224；3云南生物多樣性研究院，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224；4西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224）

基于cpDNA和rDNAITS片段分析西南地區(qū)青楊派楊樹(shù)的系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系

李佳蔓1，2，員 濤1，2，周安佩1，2，縱 丹1，2，李 旦3，何承忠1，2，4＊

（1云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224；2西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224；3云南生物多樣性研究院，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224；4西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224）

西南地區(qū)青楊派楊樹(shù)種質(zhì)資源豐富，可為楊樹(shù)遺傳改良提供珍貴的基因資源，但樹(shù)種之間形態(tài)學(xué)差異細(xì)微，該研究以山楊作為外類(lèi)群，測(cè)定了西南地區(qū)及其他地區(qū)楊屬青楊派17個(gè)種（雜種）共36份樣本的3個(gè)葉綠體片段（atpF－atpH、trnL－F和matK）和核糖體ITS片段，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以探討西南地區(qū)青楊派樹(shù)種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明：（1）在所有樣本中，3個(gè)葉綠體片段atpF－atpH、trnL－F、matK的長(zhǎng)度分別為605～634bp、957～1 010bp、819bp，3個(gè)片段拼接后的聯(lián)合序列包含29個(gè)變異位點(diǎn)和15個(gè)信息位點(diǎn)；ITS片段對(duì)齊后的長(zhǎng)度為646bp，變異位點(diǎn)19個(gè)，信息位點(diǎn)17個(gè)。（2）基于葉綠體聯(lián)合序列和ITS片段的楊屬青楊派樹(shù)種的平均遺傳距離分別為0.001 3和0.003 6。葉綠體聯(lián)合片段的MP和Bayes系統(tǒng)樹(shù)樹(shù)型基本一致，青楊派樹(shù)種可以劃分為2組，第1組由青楊、三脈青楊、大青楊和遼楊構(gòu)成；第2組中的小葉楊、小青楊、川楊、德欽楊、昌都楊、鄉(xiāng)城楊、康定楊、西南楊、滇楊和藏川楊不能有效區(qū)分，且均與緣毛楊的遺傳關(guān)系較近。（3）基于ITS的系統(tǒng)樹(shù)與葉綠體聯(lián)合片段構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)差異不大，僅在于第2組中的小青楊與小葉楊、川楊等差異明顯，與第1組中的樹(shù)種緊密聚攏。

西南地區(qū)；青楊派；葉綠體聯(lián)合片段；ITS；系統(tǒng)發(fā)育

早在1905年，Dode首次就揭示了楊屬（Populus L.）的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和種間遺傳分化，且至今依然是楊屬植物分類(lèi)學(xué)的基礎(chǔ)，其系統(tǒng)發(fā)育模型包括三亞屬六派［1］。經(jīng)過(guò)一百多年的研究，現(xiàn)通常把楊屬劃分為5派，即白楊派（Leuce）、青楊派（Tacamahaca）、黑楊派（Aigeiros）、大葉楊派（Leucoides）和胡楊派（Turanga）［23］。青楊派是楊屬中最大的一個(gè)派，中國(guó)擁有的青楊派樹(shù)種最多，分布最廣，其天然種的數(shù)量占中國(guó)楊樹(shù)天然種的一半以上［4］。其中，西南地區(qū)（主要包括四川省、云南省和西藏東南部）為楊屬青楊派樹(shù)種分布的富集區(qū)之一，其基因資源豐富，特有種多，分布廣，變異豐富，擁有大量的變種和天然雜種，這些樹(shù)種蘊(yùn)含了許多優(yōu)良種質(zhì)資源，為楊樹(shù)遺傳改良提供了珍貴的基因資源［5－9］。但由于青楊派樹(shù)種派內(nèi)種間極易進(jìn)行自然雜交，產(chǎn)生了大量的自然雜交種，而大樹(shù)上的短枝葉變異大，使其表型多樣性豐富，造成了系統(tǒng)分類(lèi)上很大的困難［10］。另外，西南地區(qū)青楊派樹(shù)種大部分處于野生狀態(tài)，其開(kāi)發(fā)和利用尚未受到研究者及公眾的普遍認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致其基因資源在楊樹(shù)遺傳改良上應(yīng)用較少。因此，開(kāi)展楊樹(shù)青楊派樹(shù)種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，不僅有助于楊屬青楊派系統(tǒng)分類(lèi)，也能夠?yàn)闂顚偾鄺钆蓸?shù)種資源的開(kāi)發(fā)和利用提供前期基礎(chǔ)。

分子生物技術(shù)的興起，為植物系統(tǒng)發(fā)育的研究開(kāi)辟了新的路徑，使其在研究方法和策略上均發(fā)生了變革［11］。在高等植物基因組中，線粒體基因組進(jìn)化速率較慢，遺傳分化較小，不適合用于系統(tǒng)發(fā)育分析［1213］，故在對(duì)植物的系統(tǒng)發(fā)育研究中，通常從核基因組和葉綠體基因組中尋找合適的片段。李巖等［14］以3株巖蕎菜屬（Aethionema L.）植株作為外類(lèi)群，結(jié)合核糖體ITS測(cè)序結(jié)果和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)數(shù)據(jù)分析了同科菘藍(lán)屬（Isatis L.）寬翅菘藍(lán)（I.violascens）27個(gè)樣的系統(tǒng)關(guān)系和分類(lèi)地位，通過(guò)構(gòu)建的最大簡(jiǎn)約樹(shù)（Maximum parsimony tree，MP tree）、最大似然樹(shù)（Maximum likelihood tree，ML tree）和貝葉斯樹(shù)（Bayesian tree）將樣本聚分為2個(gè)分支，支持將寬翅菘藍(lán)與I.emarginata合并為一個(gè)物種。高麗霞等［15］通過(guò)對(duì)27個(gè)樣地的10種棘豆屬（Oxytropis DC.）植物的54個(gè)單株的種間關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化分析，表明trnL－F序列可用于棘豆屬種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究。狄紅艷等［16］以白花草木樨（Melilotus alba）和黃花草木樨（Melilotus officinalis）的18個(gè)地理種群為材料，分析了其ITS和trnL－F序列。Gouja等［17］利用ITS、trnL－F和rbcL評(píng)價(jià)了突尼斯沙漠中沙拐棗屬（Calligonum L.）3個(gè)待定種的31份個(gè)體間的系統(tǒng)關(guān)系，3個(gè)待定種在3片段聯(lián)合后的分支圖中均表現(xiàn)出良好的單系性。

單基因片段序列能提供的信息量有限，很多研究已不再滿(mǎn)足于用單一片段序列來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的研究，如Soltis等［18］利用來(lái)自葉綠體和核基因組的3個(gè)基因片段對(duì)被子植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的研究；Bayly等［19］比較了桉樹(shù)3個(gè)屬（Eucalyptus，Corymbia，Angophora）39個(gè)樹(shù)種葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并通過(guò)構(gòu)建MP樹(shù)和Bayes樹(shù)區(qū)分了桉樹(shù)的主要分支，同時(shí)證明了葉綠體基因組變異片段能應(yīng)用于低水平遺傳距離物種間的研究。這種采用多基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建的方法逐漸被廣泛采用，成為分子系統(tǒng)發(fā)育研究的一種基本方法［20－22］。

目前對(duì)西南地區(qū)鄉(xiāng)土楊樹(shù)的分類(lèi)學(xué)研究均是基于表型特征而來(lái)，從分子生物學(xué)水平獲得的依據(jù)相對(duì)較少，僅陳珂［23］和Wan等［24］對(duì)其系統(tǒng)關(guān)系進(jìn)行了探討?；诖?，本研究以西南地區(qū)楊屬青楊派樹(shù)種為主體材料，4個(gè)北方青楊派樹(shù)種和1份小葉楊材料為補(bǔ)充材料，選取其葉綠體atpF－atpH、trnLF和matK等3個(gè)片段及核糖體ITS片段，以探討西南地區(qū)楊屬青楊派樹(shù)種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為西南地區(qū)楊屬青楊派樹(shù)種的系統(tǒng)分類(lèi)和遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

表1 楊樹(shù)樣本采集地Table 1 The sample sites of Populus

1 材料和方法

1.1 材 料

楊屬青楊派樹(shù)種于2012年9月采集于云南省西北部（香格里拉縣、德欽縣、維西縣）、四川省甘孜州（鄉(xiāng)城縣、稻城縣、理塘縣、雅江縣、康定縣、漢源縣）和西藏昌都地區(qū)（芒康縣、昌都縣、貢覺(jué)縣），1份小葉楊樣本來(lái)自于北京，小青楊、青楊和遼楊來(lái)自于內(nèi)蒙古，大青楊采自于吉林，包括青楊派17個(gè)種／雜種以及作為外類(lèi)群的白楊派山楊，共計(jì)36份樣本（表1）。鑒于本研究主要研究種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，按照分層抽樣理論，盡可能在種水平上較多選取材料，而種內(nèi)只隨機(jī)選取單株2～3株。采集楊樹(shù)各樣株幼嫩葉片，變色硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 硅膠干燥后的樣株葉片經(jīng)冷凍混合球磨儀研磨后，采用SDS法并稍加改良，提取基因組總DNA，用0.6%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測(cè)儀共同檢測(cè)DNA的濃度和純度，稀釋至所需濃度（50～100ng／μL）后于－20℃冰箱中保存。

選取在物種系統(tǒng)發(fā)育分析中應(yīng)用較廣的葉綠體atpF－atpH、trnL－F和matK3個(gè)片段，及核糖體ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列及來(lái)源見(jiàn)表2。擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25μL，其中正反引物各1μL（濃度為5pmol），DNA模板1μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，去離子水9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，退火45s（退火溫度因引物而異），72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送往北京華大基因科技股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 所得序列采用Bioedit 7.09軟件［29］進(jìn)行序列的拼接和人工校對(duì)，使用Clustal X 1.8［30］進(jìn)行多序列的對(duì)比，利用MEGA5.02［31］對(duì)序列的長(zhǎng)度、堿基組成和位點(diǎn)特性進(jìn)行分析，通過(guò)Kimura 2－parameter（K2P）模型計(jì)算種間遺傳距離。

用PAUP4b10軟件［32］對(duì)36份供試材料的aptF－atpH、trnL－F、matK、ITS片段進(jìn)行非一致性長(zhǎng)度檢驗(yàn)（ILD檢驗(yàn)），只有當(dāng)P＞0.05時(shí)才能對(duì)序列進(jìn)行合并。采用PAUP軟件的MP法和Mrbayes 3.1.2軟件的Bayes法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中，MP采用1 000次bootstrap循環(huán)［33］檢驗(yàn)各分支的支持率，并計(jì)算樹(shù)長(zhǎng)（Length）、總一致性指數(shù)（CI）、總存留指數(shù)（RI）和尺度化后的一致性指數(shù)（RC）；Bayes的模型選擇是通過(guò)Modeltest 3.7［34］比較分析，以AIC為準(zhǔn)則進(jìn)行篩選確定，采用馬兒科夫鏈的蒙特卡洛法（Markov chain Monte Carlo Process），以隨機(jī)樹(shù)為起始，運(yùn)行1 000 000代，每100代抽樣1次，舍棄2 500個(gè)老化樣本（占25%）后，以剩余樣本構(gòu)建一致樹(shù)。

表2 擴(kuò)增引物及來(lái)源Table 2 PCR primers and sources used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列的差異分析

由表3可看出，36份楊樹(shù)材料的atpF－atpH、trnL－F和matK片段的平均長(zhǎng)度分別為629（605～634）、995（957～1010）和819bp，其中trnL－F片段序列包含的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)數(shù)最多，分別為12個(gè)和8個(gè)。3個(gè)葉綠體片段聯(lián)合后的長(zhǎng)度為2 381～2 463bp，平均長(zhǎng)度為2 443bp，其中，變異位點(diǎn)29個(gè)，信息位點(diǎn)15個(gè)，G＋C含量為31.6%。ITS片段的長(zhǎng)度范圍為635～645bp，平均長(zhǎng)度為642 bp，含有變異位點(diǎn)19個(gè)，信息位點(diǎn)17個(gè)，G＋C含量為65.5%。

表3 atpF－atpH、trnL－F、matK、ITS片段的序列特征Table 3 Characteristics of the atpF－atpH，trnL－F，matKand ITSsequences

表4 青楊派樹(shù)種間的遺傳距離Table4 GeneticdistancesamongspeciesinsectionTacamahaca

2.2 楊樹(shù)青楊派樹(shù)種的遺傳距離分析

以青楊派17個(gè)種和雜種及外類(lèi)群山楊的cpDNA及ITS序列做為數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)，采用MEGA軟件的K2P模型計(jì)算樹(shù)種之間的遺傳距離（表4）?；谌~綠體聯(lián)合片段的遺傳距離表明，除去疑似種和外類(lèi)群，青楊派樹(shù)種的平均遺傳距離較小，為0.001 3，可分為2組。三脈青楊、青楊、大青楊和遼楊4個(gè)樹(shù)種共同組成第1組，組內(nèi)樹(shù)種的遺傳距離在0.0000～0.001 7之間；剩余樹(shù)種為第2組，組內(nèi)遺傳距離較?。?.0000～0.000 6）；2個(gè)組樹(shù)種間的遺傳距離在0.002 5～0.004 0之間。ITS序列間的平均遺傳距離為0.003 6，同樣可分為2組，分組情況與葉綠體聯(lián)合片段類(lèi)似，第1組僅多了小青楊，組內(nèi)遺傳距離較?。?.0000～0.003 2），第2組（不含小青楊）的組內(nèi)遺傳距離較大（0.0000～0.011 0）。

圖1 基于atpF－atpH、trnL－F、matK片段楊屬青楊派樹(shù)種的最大簡(jiǎn)約樹(shù)節(jié)點(diǎn)處僅顯示超過(guò)50%的置信值（Bootstrap支持率）Fig.1 Maximum parsimony tree in sect.Tacamahacaof Populus based on atpF－atpH，trnL－Fand matK Confidence values（Bootstrap support values）are reported for nodes over 50%

圖2 基于atpF－atpH、trnL－F、matK片段楊屬青楊派樹(shù)種的貝葉斯樹(shù)節(jié)點(diǎn)處僅顯示超過(guò)50%的置信值（后驗(yàn)概率）Fig.2 Bayesian tree in sect.Tacamahacaof Populus based on atpF－atpH，trnL－Fand matK Confidence values（posterior probability values）are reported for nodes over 50%

2.3 楊屬青楊派樹(shù)種的系統(tǒng)發(fā)育分析

單獨(dú)分析葉綠體atpF－atpH、trnL－F和matK片段的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其支持率和分辨率均較低，通過(guò)ILD檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，3種片段具有極高的同質(zhì)性（P＝1.00＞0.05），因此，合并后的聯(lián)合片段可以用于系統(tǒng)發(fā)育分析。其中，MP樹(shù)的一致性指數(shù)（CI）為0.909 1，保持性指數(shù)（RI）為0.969 2，存留一致性指數(shù)（RC）為0.881 1；Bayes樹(shù)的最佳進(jìn)化模型為F81＋I(xiàn)。用兩種方法得到的系統(tǒng)樹(shù)樹(shù)型相似（圖1和圖2），均先分離作為外類(lèi)群的3株山楊，然后將青楊派樹(shù)種分為2個(gè)分支，第1分支包括青楊、遼楊、大青楊、三脈青楊和疑似藏川楊的天然雜種，其置信值達(dá)83%（MP樹(shù)）和100%（Bayes樹(shù)），其中，青楊和遼楊具有極高的相似性，MP和Bayes的置信值分別為94%和100%；其余26株青楊派樹(shù)種構(gòu)成第2分支（MP樹(shù)和Bayes樹(shù)的置信值分別為64%和96%），其中，緣毛楊、疑似雜交種和1株川楊個(gè)體位于第2分支的基部，而小葉楊、滇楊、小青楊、川楊（1個(gè)個(gè)體）、藏川楊、鄉(xiāng)城楊、康定楊、西南楊、昌都楊和德欽楊則以姐妹種的形式聚類(lèi)，其分支互為平行支，表明這10個(gè)種之間的系統(tǒng)關(guān)系不夠明確。

基于ITS片段的MP樹(shù)（CI＝0.863 6，RI＝0.958 3，RC＝0.827 7）和Bayes樹(shù)（最佳進(jìn)化模型為T(mén)rN＋I(xiàn)）的分析表明，兩種系統(tǒng)樹(shù)均表明所有青楊派樹(shù)種聚在一起，與外類(lèi)群山楊明顯分離，而青楊派樹(shù)種也分為2個(gè)分支，其中遼楊、青楊、小青楊、大青楊和三脈青楊為第1分支，位于系統(tǒng)樹(shù)的基部，MP樹(shù)和Bayes樹(shù)的置信值分別為53%和71%。其余的樹(shù)種構(gòu)成第2分支，位于系統(tǒng)樹(shù)的頂部，其MP樹(shù)和Bayes樹(shù)的置信值分別為50%和96%。在第2分支中，MP樹(shù)（圖3）和Bayes樹(shù)（圖4）的樹(shù)型有一定的差異，其中MP樹(shù)首先分出2株小葉楊，最后分出3株昌都楊和1株疑似藏川楊的天然雜種，而B(niǎo)ayes樹(shù)中，2株小葉楊個(gè)體以73%的置信值聚類(lèi)后，再與其他楊樹(shù)個(gè)體呈姐妹種關(guān)系相聚。由此可見(jiàn)，基于ITS序列依然不能夠明確第2分支樹(shù)種之間的系統(tǒng)關(guān)系。

圖4 基于ITS片段楊屬青楊派樹(shù)種的貝葉斯樹(shù)節(jié)點(diǎn)處僅顯示超過(guò)50%的置信值（后驗(yàn)概率）Fig.4 Bayesian tree in sect.Tacamahacaof Populus based on ITS Confidence values（posterior probability values）are reported for nodes over 50%

3 討 論

3.1 青楊派楊樹(shù)cpDNA和ITS片段的序列特征

高等植物細(xì)胞中具有3個(gè)基因組，即核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組，由于陸地植物的線粒體基因進(jìn)化速率相對(duì)較慢，并不適合用于系統(tǒng)發(fā)育的研究，故而對(duì)植物的研究主要集中于核基因組和葉綠體基因組［35－37］。衛(wèi)尊征等［38］對(duì)楊屬4派17個(gè)主要栽培種及雜種共計(jì)26個(gè)單株的trnL－F間隔區(qū)序列進(jìn)行了研究，其結(jié)果顯示，26個(gè)單株基因trnL－F間隔區(qū)序列的長(zhǎng)度為771～811bp，對(duì)齊后長(zhǎng)度為857bp，具有46個(gè)變異位點(diǎn)，33個(gè)信息位點(diǎn)。而本研究中，trnL－F片段的長(zhǎng)度為957～1 010 bp，對(duì)齊后為995bp，變異位點(diǎn)12個(gè)，信息位點(diǎn)8個(gè)，與前者所報(bào)道的結(jié)構(gòu)具有一定的差異，主要原因可能為取材不同（前者包含楊屬4個(gè)派，本研究?jī)H為青楊派樹(shù)種）、外類(lèi)群（前者為同科不同屬的蒿柳和極地柳，本研究為同屬不同派的山楊）和序列片段范圍（前者根據(jù)序列自行設(shè)計(jì)800bp左右的引物，本研究采用Taberlet開(kāi)發(fā)的通用引物）的選擇不同。

ITS為核糖體DNA（nrDNA）的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列片段，由于其進(jìn)化速率快而被廣泛應(yīng)用于屬和屬以下分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育研究中［28，39－41］。如Abdollahzadeh等［42］以楊樹(shù)2個(gè)種為外類(lèi)群，構(gòu)建了柳樹(shù)55個(gè)種62個(gè)樣ITS片段的MP樹(shù)和Bayes樹(shù)。Yost等［43］利用ITS片段分析景天科（Crassulaceae）仙女杯屬（Dudleya）二倍體物種的系統(tǒng)發(fā)育和三倍體物種的進(jìn)化起源，結(jié)果表明二倍體物種雖可分成4個(gè)分支，但很多種間關(guān)系尚不能確定，三倍體物種ITS片段上的信息量也不足以解決其起源問(wèn)題。在楊樹(shù)的ITS研究中，史全良等［44］以旱柳和簸箕柳為外類(lèi)群，對(duì)楊屬5派15個(gè)代表種的ITS片段進(jìn)行了分析，其結(jié)果表明，ITS1和ITS2長(zhǎng)度分別為220～223bp與201～210bp，5.8S為164 bp，總長(zhǎng)度為594bp，共有92個(gè)變異位點(diǎn)和61個(gè)信息位點(diǎn)，其中ITS1中變異位點(diǎn)39個(gè)，信息位點(diǎn)17個(gè)，ITS2的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)分別為48個(gè)和44個(gè)。而在本研究中，ITS片段的序列長(zhǎng)度為635～645bp，平均為642bp，對(duì)齊后為646bp，變異位點(diǎn)只有19個(gè)，信息位點(diǎn)為17個(gè)，與前者的報(bào)道有一定的差異，主要也是由于研究材料、外類(lèi)群選擇以及序列片段范圍選擇的不同造成的。

3.2 西南地區(qū)青楊派樹(shù)種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

中國(guó)西南地區(qū)既有高原平面又有高山峽谷，地形地貌復(fù)雜，立體氣候和環(huán)境多樣，冰川活動(dòng)，人文地史條件獨(dú)特，特別是橫斷山區(qū)以山川駢列，南北走向，在第四紀(jì)冰期來(lái)臨時(shí)，為植物的退避提供了優(yōu)異的條件，為主要分布于北半球溫帶和寒帶的楊樹(shù)退避提供了通道［5］。因此，使該區(qū)孕育了豐富的生物資源，楊樹(shù)種類(lèi)之多，性狀變異之豐富，是世界其他地方少有的［7］。然而，據(jù)現(xiàn)有資料報(bào)道，西南地區(qū)分布的青楊派鄉(xiāng)土楊樹(shù)既有廣布樹(shù)種，如小葉楊、青楊、滇楊、川楊、藏川楊等，也有地域性較強(qiáng)的窄布樹(shù)種（或稱(chēng)為地方小種），如德欽楊、康定楊、鄉(xiāng)城楊、西南楊、三脈青楊、昌都楊等，且其形態(tài)特征一般與廣布樹(shù)種十分相似，僅存細(xì)微差異，如西南楊與青楊相似，僅是西南楊的枝、葉、果序和果均密被毛；鄉(xiāng)城楊與川楊相似，僅是鄉(xiāng)城楊的小枝、葉柄、葉脈和果序軸均被毛［2，6，45］。

不可否認(rèn)的是，形態(tài)特征的差異是經(jīng)典分類(lèi)學(xué)中劃分植物不同種類(lèi)的重要依據(jù)，而微小的差異也可能是同一物種在異質(zhì)環(huán)境條件中長(zhǎng)期進(jìn)化的適應(yīng)性表現(xiàn)。尤其是中國(guó)西南地區(qū)，物種分布區(qū)域的山脈阻隔特點(diǎn)突出，地勢(shì)高峻，冰川作用強(qiáng)烈［46］。而冰川作用更是促進(jìn)植物演化的主要?jiǎng)恿Γ看伪跉夂騺?lái)臨，植物在寒冷氣候作用下必然不斷地產(chǎn)生適應(yīng)性，以新的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和習(xí)性適應(yīng)新的環(huán)境。由此引出的問(wèn)題是，當(dāng)前西南地區(qū)分布的特有楊樹(shù)種，是否由于氣候條件的變化、因地理隔離和地域間氣候條件的差異而由原來(lái)的廣布樹(shù)種在形態(tài)特征等方面產(chǎn)生適應(yīng)性？趙能等［8］依據(jù)表型性狀將西南楊歸為康定楊的變種。而Wan等［24］利用AFLP標(biāo)記和葉綠體trnT－F片段對(duì)西南地區(qū)38份楊樹(shù)材料的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明西南楊可能并非康定楊的變種，而是康定楊和青楊的自然雜交種。本研究對(duì)西南地區(qū)楊屬青楊派樹(shù)種的研究結(jié)果表明，基于葉綠體基因組atpF－atpH、trnL－F和matK聯(lián)合片段的MP和Bayes系統(tǒng)樹(shù)基本一致，小葉楊、小青楊、川楊、德欽楊、昌都楊、鄉(xiāng)城楊、康定楊、西南楊、滇楊、藏川楊以姐妹種的形式共同聚為一個(gè)分支，之間的系統(tǒng)關(guān)系不能確定。他們與緣毛楊的遺傳關(guān)系較近，但卻與青楊、三脈青楊、大青楊、遼楊所構(gòu)成的分支遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。基于ITS的MP和Bayes系統(tǒng)樹(shù)與葉綠體基因組聯(lián)合片段的系統(tǒng)樹(shù)差異不大，其主要不同在于小青楊與青楊、遼楊等楊樹(shù)緊密聚在一起，表明小青楊很可能為青楊派2個(gè)分支樹(shù)種所產(chǎn)生的古老自然雜交種。

通過(guò)比較形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系發(fā)現(xiàn)，有些形態(tài)特征相似的樹(shù)種在系統(tǒng)樹(shù)中緊密聚類(lèi)，如鄉(xiāng)城楊、德欽楊、昌都楊、康定楊、藏川楊、川楊、滇楊等，但地方小種如德欽楊、康定楊、鄉(xiāng)城楊等是否為廣布樹(shù)種小葉楊、川楊、藏川楊、滇楊等的一種環(huán)境適應(yīng)型尚不能確定，有待進(jìn)一步研究。此外，青楊與川楊、滇楊、西南楊等樹(shù)種之間，三脈青楊和小葉楊之間的形態(tài)特征相近，但從遺傳關(guān)系來(lái)看，無(wú)論是基于葉綠體基因組、還是核基因組ITS片段，都表明他們之間具有明顯的差異，這很可能是楊屬派內(nèi)種間頻繁地自然雜交現(xiàn)象所導(dǎo)致。

綜上所述，西南地區(qū)青楊派鄉(xiāng)土樹(shù)種之間的遺傳關(guān)系較為復(fù)雜，雖然趙能等［6－9］經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，基于形態(tài)特征建立了西南地區(qū)鄉(xiāng)土楊樹(shù)的分類(lèi)系統(tǒng)，但從分子生物學(xué)方面開(kāi)展的研究卻較少。本研究基于葉綠體基因組3個(gè)片段的聯(lián)合和核基因組ITS序列分析了該區(qū)域青楊派樹(shù)種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，初步將西南地區(qū)青楊派樹(shù)種歸為2個(gè)分支，第1分支為采集于該地區(qū)的小葉楊、滇楊、川楊、藏川楊、鄉(xiāng)城楊、康定楊、西南楊、昌都楊、德欽楊，第2分支為三脈青楊，但每個(gè)分支內(nèi)的樹(shù)種系統(tǒng)關(guān)系仍不能夠明確，需要借助更多的分子生物學(xué)技術(shù)深入地開(kāi)展研究。

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（編輯：宋亞珍）

Phylogeny of Poplar in Section TacamahacaSpecies from Southwest China Based on Sequence Data of cpDNA Fragments and rDNAITS

LI Jiaman1，2，YUN Tao1，2，ZHOU Anpei1，2，ZONG Dan1，2，LI Dan3，HE Chengzhong1，2，4＊
（1Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement ＆Propagation in Universities of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；2Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；3Yunnan Academy of Biodiversity，Southwest Forestry U－niversity，Kunming 650224，China；4Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Despite abundant germplasm resources in Southwest China for poplar genetic improvement，the varied species exist tiny difference in morphology and have unknown systematic relationship.Using Populus davidianaas outgroup，the phylogenetic relationship of 36specimens covering 17species or hybrids collected from Southwest China and other areas was explored based on sequence data of chloroplast atpF－atpH，trnL－F，matKand nuclear ITS.The results showed that：（1）the ranges of length in atpF－atpH，trnL－Fand matKwere 605－634bp，957－1 010bp and 819bp respectively，and the combination of 3chloroplast fragments had 29variable sites and 15informative sites，while the aligned length of ITSfragment including 19variable sites and 17informative sites was 646bp.（2）The average genetic distance among all samples of chloroplast combination was 0.001 3and that of ITSfragment was 0.003 6.Based on chloroplast combination data，the result of MP tree was consistent with that of Bayesian algorithms and both suggested the Populus section Tacamahacaspecies were divided into 2clades，of which，clade 1was formed by P.cathayana，P.trinervis，P.ussuriensis，P.maximowiczii，and the species in clade 2，namely，P.simonii，P.pseudosimonii，P.szechuanica，P.haoana，P.qamdoensis，P.xiangchengensis，P.kangdingensis，P.schneideri，P.yunnanensis，P.szechuanicavar.tibetica，could not be clearly separated and had close relationship with P.ciliata.（3）Although a few differences in phylogenetic tree based on chloroplast combination data，ITS fragment provided that P.pseudo－simonii existed closer affinity with other species in clade 1（e.g.P.simonii and P.szechuanica）but larger genetic distance with others in clade 2.The results of this study made a understand on the phylogeny of poplar in section Tacamahacaspecies from Southwest China，and provided a scientific bases for their systematic classification and evolutionary relationship.

Southwest China；Tacamahaca；chloroplast combination；ITS；phylogeny

Q789

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1113

1000－4025（2015）06－1113－10

2015－02－06；修改稿收到日期：2015－05－17

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)（201104076）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31360184，31460205）；云南省教育廳基金（2014J099）；云南省中青年學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)基金（2012HB021）

李佳蔓（1989－），女，在讀碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。E－mail：lijiaman16＠126.com

＊通信作者：何承忠，博士，教授，主要從事林木遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E－mail：hcz70＠163.com