5,7,4'-三羥基取代黃酮化合物與牛血清白蛋白的相互作用

王琳琳, 朱靖博,2, 寇自農(nóng), 丁 燕,2, 楊榮榮

5,7,4'-三羥基取代黃酮化合物與牛血清白蛋白的相互作用

王琳琳1, 朱靖博1,2, 寇自農(nóng)3, 丁 燕1,2, 楊榮榮1

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034; 2.大連工業(yè)大學(xué)植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所,遼寧大連 116034; 3.大連工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器中心,遼寧大連 116034)

利用熒光光譜法與紫外光譜法研究5,7,4'-三羥基取代類黃酮化合物芹菜素、柚皮素和染料木素與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合,探討了C環(huán)氫化及取代位置對(duì)其與BSA相互作用的影響。結(jié)果表明,3種化合物對(duì)BSA內(nèi)源性熒光均有猝滅作用,且猝滅類型為靜態(tài)猝滅;3種化合物與BSA的結(jié)合位點(diǎn)約為1,在295 K條件下,與BSA結(jié)合由強(qiáng)到弱順序?yàn)榍鄄怂?、染料木素、柚皮?結(jié)合常數(shù)分別為1.269× 107、3.011×105和1.342×105L/mol;芹菜素主要通過氫鍵與范德華力與BSA結(jié)合,柚皮素和染料木素主要通過靜電作用與BSA結(jié)合;說明具有相同A環(huán)與B環(huán)結(jié)構(gòu)的黃酮化合物,C環(huán)氫化后削弱其與BSA的作用,B環(huán)連接在C-2位置上與BSA的結(jié)合作用更強(qiáng)。3種化合物的加入均改變了BSA酪氨酸殘基與色氨酸殘基的微環(huán)境;同時(shí)也改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基,與BSA均形成了復(fù)合物。

5,7,4'-三羥基取代黃酮化合物;芹菜素;柚皮素;染料木素;牛血清白蛋白;熒光光譜法;紫外光譜法

0 引 言

黃酮化合物是一類植物中分布很廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物,具有重要的藥理活性[1],化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有C6—C3—C6的基本骨架。黃酮類廣泛的生物活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性有緊密的聯(lián)系,其中5,7,4'-三羥基取代類黃酮化合物是黃酮類化合物中重要的代表,根據(jù)C環(huán)的結(jié)構(gòu)與取代基位置的不同,作者選取3種化合物為研究對(duì)象,分別為5,7,4'-三羥基黃酮(芹菜素)、5,7,4'-三羥基二氫黃酮(柚皮素)與5,7,4'-三羥基異黃酮(染料木素)(見圖1),化學(xué)結(jié)構(gòu)的異同影響其與牛血清白蛋白的相互作用[2]。

黃酮類化合物可以與蛋白或者其他大分子物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合。人血白蛋白是人血液中非常重要的載體蛋白,可與多種內(nèi)源性與外源性藥物結(jié)合并運(yùn)送到身體的各部位發(fā)揮藥效[3-4]。白蛋白本身是一種具有內(nèi)源性熒光的大分子物質(zhì),一些藥物小分子與其結(jié)合后會(huì)引起蛋白本身的吸收與發(fā)射光譜的特異性變化[5-7],熒光光譜法與紫外光譜法可以快捷有效地反映小分子與白蛋白的作用情況,目前已用光譜法研究了槲皮素[8]、蘆丁[9]、金絲桃苷[10]、橙黃決明素[11]和丹參素[12]等與牛血清白蛋白的相互作用。本文以熒光光譜法與紫外光譜法為主要研究方法,通過探究5,7,4'-三羥基取代類黃酮化合物對(duì)牛血清白蛋白的熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合常數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)及作用力的類型、對(duì)肽鏈及氨基酸殘基微環(huán)境的影響及與白蛋白是否結(jié)合成復(fù)合物等方面,研究了這3種化合物與牛血清白蛋白相互作用的聯(lián)系與區(qū)別。

圖1 芹菜素、柚皮素與染料木素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of apigenin,naringenin and genistein

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1儀器與試劑

LS-55型熒光光度計(jì),美國PE公司; UV2101PC紫外-可見分光光度計(jì),上海Unico公司;芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物有限公司;柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品,北京百靈威科技有限公司;染料木素標(biāo)準(zhǔn)品,大連博邁科技發(fā)展有限公司;以上標(biāo)準(zhǔn)品均用無水甲醇配制成2.90×10-4mol/L;牛血清白蛋白(Sigma公司)用p H 7.4的Tris-HCL緩沖液配制成5.0×10-5mol/L的儲(chǔ)備液;其他試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜

分別移取0.5 m L BSA儲(chǔ)備液于10 m L刻度試管中,依次加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用Tris-HCL緩沖液定容至5 m L,混合均勻并靜置5 min。以280 nm為激發(fā)波長,激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為5.0、2.5 nm,掃描速度為600 nm/min,在熒光光譜儀上記錄285～500 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射波長;固定Δλ=15 nm或Δλ=60 nm,記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液與BSA作用的同步熒光光譜。

1.2.2 紫外光譜

分別移取0.5 m L BSA儲(chǔ)備液于10 m L刻度試管中,依次加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用Tris-HCL緩沖液定容至5 m L,混合均勻并靜置5 min,在紫外分光光度計(jì)上,以Tris-HCL緩沖液為對(duì)照品進(jìn)行紫外光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.13種黃酮類化合物對(duì)BSA熒光的猝滅

BSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基,在280 nm激發(fā)下能產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源熒光[13]。如圖2所示,室溫下,在保持BSA濃度固定不變的情況下,隨著3種化合物濃度的逐漸增加,BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度均逐漸降低,最大發(fā)射波長及峰形保持不變。這表明,這3種化合物與BSA發(fā)生了相互作用,可以猝滅BSA的熒光。在相同濃度下,柚皮素與染料木素對(duì)BSA熒光強(qiáng)度的猝滅程度相近,當(dāng)濃度達(dá)到20.30μmol/L時(shí),這2種化合物與BSA作用后的熒光強(qiáng)度達(dá)到219.46和193.89,而芹菜素對(duì)BSA的熒光強(qiáng)度猝滅較明顯,在濃度為20.30μmol/L時(shí),其與BSA作用后的熒光強(qiáng)度達(dá)到96.6。這表明,在羥基取代位置及A環(huán)與B環(huán)結(jié)構(gòu)相同的情況下,相同濃度的黃酮類化合物對(duì)BSA的猝滅作用最強(qiáng),異黃酮類其次,二氫黃酮最弱。

圖2 3種黃酮類化合物對(duì)BSA熒光的猝滅作用Fig.2 Effects of three flavonoids on fluorescence spectra of BSA

外源性物質(zhì)對(duì)BSA內(nèi)源性熒光猝滅有靜態(tài)與動(dòng)態(tài)兩種方式。通常認(rèn)為,分子間的有效碰撞和電子轉(zhuǎn)移過程是引起動(dòng)態(tài)猝滅的主要原因,溫度的升高加速了分子間的有效碰撞,使動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)增大。若是靜態(tài)猝滅,溫度升高降低配合物的穩(wěn)定性,使猝滅常數(shù)減小。動(dòng)態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程[14]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)其中,F0與F分別是未加入與加入猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度;[Q]為藥物總濃度;Kq為猝滅速率常數(shù),各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s);τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的平均壽命,一般約為10-8s; KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。

根據(jù)方程(1),繪制了在295、305及315 K下的Stern-Volmer方程曲線圖,如圖3所示。從各圖中可以看出,隨著溫度的增高,斜率均逐漸降低。由方程(1)計(jì)算得到的不同溫度下的3種物質(zhì)的KSV與Kq如表1所示,可看出KSV隨著溫度的升高而減小,且Kq均大于最大碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)。由此可以推斷,引起猝滅的原因是這3種黃酮類化合物分別與BSA發(fā)生了相互作用,對(duì)BSA內(nèi)源性熒光猝滅過程應(yīng)為靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下芹菜素、柚皮素、染料木素與BSA體系的KSV與KqTab.1 Stern-Volmer KSVand Kqof the BSA-apigenin, naringenin and genistein interaction at different temperatures

圖3 不同溫度下3種黃酮類猝滅BSA的Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots for quenching of BSA fluorescence by three flavonoids at different temperatures

2.23種黃酮類化合物與BSA結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

靜態(tài)猝滅作用是指熒光分子與熒光猝滅劑之間借助分子間作用力,彼此結(jié)合成具有一定結(jié)構(gòu)的復(fù)合物,而導(dǎo)致熒光體系熒光強(qiáng)度的減弱[15],用靜態(tài)猝滅公式計(jì)算結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù):

lg[(F0-F)/F]=lg KA+n lg[Q](2)其中,KA是結(jié)合常數(shù),n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。根據(jù)公式(2)處理數(shù)據(jù),以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖可得一直線,如圖4所示。根據(jù)斜率與截距可計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)KA與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,如表2所示。3種化合物的結(jié)合為點(diǎn)數(shù)n均約為1,表明每個(gè)BSA分子可結(jié)合1個(gè)黃酮化合物分子。3種化合物的KA隨溫度的變化不大,可推斷出化合物與BSA之間已形成穩(wěn)定的復(fù)合物,且3種黃酮類化合物與BSA結(jié)合的強(qiáng)弱順序?yàn)榍鄄怂?、染料木素、柚皮素?？梢?A環(huán)與B環(huán)結(jié)構(gòu)相同的黃酮化合物,C環(huán)氫化后削弱其與BSA的作用,B環(huán)連接在C-2位置比連接在C-3位置時(shí)與BSA的結(jié)合高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖4 3種黃酮類化合物在不同溫度下猝滅BSA的lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]圖Fig.4 Plots of lg[(F0-F)/F]versus lg[Q]for three flavonoids quenching effect on BSA fluorescence different temperatures

表2 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)KA與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTab.2 Binding constant KAand the number of binding sites n at different temperatures

2.3 3種黃酮類化合物與BSA結(jié)合的熱力學(xué)分析和結(jié)合力類型的確定

在配體-蛋白質(zhì)結(jié)合的過程中,主要有4種非共價(jià)相互作用力:氫鍵作用力、范德華力、疏水作用力和靜電作用力。不同藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合力的類型是不同的,可根據(jù)化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)前后的焓變?chǔ)和熵變?chǔ)來判斷二者間的主要作用力,在溫度變化范圍不大的情況下,ΔH可看作一個(gè)常數(shù)。可根據(jù)公式(3)和(4)來計(jì)算,計(jì)算結(jié)果見表3。

其中,K是相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù),R是氣體常數(shù),T是絕對(duì)溫度。

表3 芹菜素、柚皮素和染料木素與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters of interaction of the three flavonoids and BSA

當(dāng)ΔS＞0,ΔH＞0為典型疏水作用力;ΔH＜0,ΔS＜0時(shí)為氫鍵和范德華力;ΔH＜0,ΔS＞0時(shí),主要存在靜電相互作用。由表3可知,3種化合物與BSA反應(yīng)的ΔG均小于0,這說明芹菜素、柚皮素和染料木素與BSA的結(jié)合是一個(gè)放熱反應(yīng),是一個(gè)自發(fā)進(jìn)行的過程。其中,芹菜素與BSA的反應(yīng)過程中,ΔH＜0,ΔS＜0,表明二者之間的作用力主要是氫鍵與范德華力;柚皮素與BSA的反應(yīng)過程中,ΔH＜0,ΔS＞0,表明二者之間的作用力主要是靜電作用;染料木素與BSA的反應(yīng)過程中,ΔH＜0,ΔS＞0,表明二者之間的作用力主要是靜電作用。

2.4 3種黃酮類化合物的同步熒光光譜

同步熒光法研究化合物對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。BSA中含有的色氨酸、酪氨酸與苯丙氨酸可以發(fā)射內(nèi)源性熒光,通常情況下,Δλ=15 nm時(shí)得到的熒光光譜反應(yīng)的是蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的光譜特征,Δλ=60 nm時(shí)得到的是色氨酸殘基的光譜特征。這3種黃酮類化合物與BSA結(jié)合的同步熒光光譜如圖5所示。由圖5可知,這3種化合物與BSA體系的同步熒光光譜呈現(xiàn)相同的規(guī)律。隨著化合物濃度的增加,酪氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生了微弱的藍(lán)移,藍(lán)移1 nm,而色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移,紅移2 nm。這表明3種黃酮類化合物的加入改變了BSA酪氨酸殘基的微環(huán)境,使其極性增大,同時(shí)也改變了色氨酸殘基的微環(huán)境,使其極性減小,引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

圖5 芹菜素、柚皮素及染料木素-BSA體系的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of apigenin,naringenin,genistein-BSA systems

2.53種黃酮類化合物的紫外光譜

紫外-分光光譜法是檢測(cè)化合物與BSA是否形成復(fù)合物的有效方法,可研究小分子對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。吸收波長在190～230 nm的紫外吸收光譜可反映蛋白質(zhì)主鏈的信息,在280 nm的紫外吸收光譜可反映芳香族氨基酸殘基的信息。圖6為3種化合物與BSA相互作用的紫外光譜。由圖6可知,這3種化合物與BSA體系的紫外光譜在波長為220與280 nm處有明顯的吸收峰,隨著化合物濃度的增大,220 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增大,這表明3種化合物與BSA之間均存在相互作用;280 nm處的吸收強(qiáng)度均逐漸增大,但芹菜素與染料木素的吸收峰伴隨明顯紅移,說明這2種化合物與BSA結(jié)合后改變了芳香族殘基的微環(huán)境,使其極性減小,而柚皮素的吸收峰有輕微藍(lán)移,說明柚皮素與BSA的結(jié)合使芳香族殘基的微環(huán)境極性增大。以上結(jié)果均表明這3種黃酮類化合物與BSA均形成了復(fù)合物。

圖6 3種黃酮類化合物與BSA相互作用的紫外光譜Fig.6 Ultraviolet spectra of three flavonoids-BSA systems

3 結(jié) 論

利用熒光光譜法與紫外光譜法研究芹菜素、柚皮素和染料木素與BSA的結(jié)合規(guī)律,探討了3種5,7,4'-三羥基取代類黃酮化合物中C環(huán)氫化及取代位置對(duì)其與BSA相互作用的影響。結(jié)果顯示,3種化合物對(duì)BSA內(nèi)源性熒光均有猝滅作用且猝滅類型為靜態(tài)猝滅;3種化合物與BSA的結(jié)合位點(diǎn)約為1,在295 K條件下與BSA結(jié)合的強(qiáng)弱順序?yàn)榍鄄怂?、染料木素、柚皮?芹菜素主要通過氫鍵與范德華力與BSA結(jié)合,柚皮素和染料木素與主要通過靜電作用與BSA結(jié)合;這表明,具有相同A環(huán)與B環(huán)結(jié)構(gòu)的黃酮化合物,C環(huán)氫化后削弱其與BSA的作用,且B環(huán)連接在C-2位置比連接在C-3位置時(shí)與BSA的結(jié)合常數(shù)高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。3種化合物的加入均改變了BSA酪氨酸殘基與色氨酸殘基的微環(huán)境,同時(shí)也改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基,3種化合物與BSA均形成了復(fù)合物。

[1]汪雙雙,倪永年.光譜法研究11-羥基喜樹堿與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析試驗(yàn)室,2010,29 (1):10-12.

[2]張國文,陳秀霞.熒光法研究3種黃酮化合物與牛血清白蛋白的結(jié)合作用[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32 (2):140-144.

[3]張建剛,衛(wèi)艷麗,張麗,等.氨基黑10B與牛血清白蛋白作用的光譜法研究[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào),2011,27 (3):170-173.

[4]郭燕青,李建晴,衛(wèi)艷麗,等.熒光光譜法研究熒光桃紅與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2007,23(3):277-278.

[5]張建剛,衛(wèi)艷麗,董川,等.番紅花紅T與牛血清白蛋白作用的光譜特性[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2011,28(3): 1355-1359.

[6]GE Feng,JIANG Lixiang,LIU Diqiu,et al.Interaction between alizarin and human serum albumin by fluorescence spectroscopy[J].Analytical Sciences, 2011,27:79-84.

[7]陳國珍,黃賢智,許金鉤,等.熒光分析法[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1990-1992.

[8]王春,吳秋華,王志,等.槲皮素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2006,26(9): 1672-1674.

[9]欒妮娜,吳錦繡,宋玉民,等.槐米中蘆丁的提取及其與人血清白蛋白熒光光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(4):856-859.

[10]李滿秀,竇艷枝.金絲桃苷與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2011,30(5):46-48.

[11]寇自農(nóng),徐龍權(quán).橙黃決明素的制備及其與牛血清白蛋白的相互作用[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013, 32(1):18-19.

(KOU Zinong,XU Longquan.Preparation of aurantio-obtusin and its interaction with bovine serum albumin[J].Journal of Dalian Polytechnic University,2013,32(1):18-19.)

[12]張曦,寇自農(nóng),石羽佳,等.同步熒光光譜法研究丹參素-牛血清白蛋白體系的熒光增強(qiáng)效應(yīng)[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2011,30(4):444-445.

[13]楊曼曼,楊穎,席小莉,等.熒光染料探針與蛋白質(zhì)結(jié)合的研究[J].科學(xué)通報(bào),1997,42(12):1276-1278.

[14]鄧世星,楊季東.熒光法研究牛血清白蛋白與中性紅的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(2): 177-179.

[15]查丹明,李舒婷,楊勇飛,等.稀土金屬離子與色氨酸相互作用的熒光光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,1999,19(6):788-790.

Interaction of bovine serum albumin with 5,7,4'-trihydroxy substituent flavonoids

WANG Linlin1, ZHU Jingbo1,2, KOU Zinong3, DING Yan1,2, YANG Rongrong1
(1.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Institute of Chemistry and Applications of Plant Resources,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 3.Instrumental Analysis Center,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

The interactions among 5,7,4'-trihydroxy substituent flavonoids apigenin,naringenin, genistein and bovine serum albumin(BSA)were investigated by fluorescence spectroscopy and ultraviolet spectroscopy.The effect of hydrogenation on C ring and the position of substituent on C ring on the affinity for BSA was discussed.Experimental results showed that the three flavonoids could quench BSA fluorescence and the quenching mechanism was static quenching.The binding numbers were all about 1.The descending order of binding force was apigenin(flavone),genistein (flavanone)and naringenin(isoflavone),the binding constant of which were 1.269×107,3.011×105and 1.342×105L/mol at 295 K.The binding force between apigenin and BSA was mainly hydrogen bonding and van der Waals force,naringenin and genistein’s were both electrostatic interaction.The results indicated that hydrogenation on ring C could lower the affinity to BSA,while the B ring connected to the C-2 position could enhance the affinity to BSA.The three flavonoids changed the microenvironment of tyrosine and tryptophan.The three flavonoids were formed compound with BSA,and also changed the protein secondary structure and amino acid residues microenvironment.

5,7,4'-trihydroxy substituent flavonoids;apigenin;naringenin;genistein;bovine serum albumin;fluorescence spectroscopy;ultraviolet spectroscopy

O657.3

:A

1674-1404(2015)05-0320-06

2014-03-12.

遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺(tái)項(xiàng)目(2011191).

王琳琳(1988-),女,碩士研究生;通信作者:朱靖博(1963-),男,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:zhujingb@sina.com.