用大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白

溫子健, 錢 方, 妥彥峰, 姜淑娟, 牟光慶

用大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白

溫子健, 錢 方, 妥彥峰, 姜淑娟, 牟光慶

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034)

根據(jù)大豆乳清廢水特性,直接發(fā)酵熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、白假絲酵母、皺褶假絲酵母、白地霉、藍(lán)莓酵母、核酸酵母、酒精酵母等8種酵母菌,其中產(chǎn)朊假絲酵母的產(chǎn)量最大。對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母利用大豆乳清廢水培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了裝液量為20%、接種量5%、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時(shí)間22 h為適宜條件,優(yōu)化后其菌體干重產(chǎn)量達(dá)到3.26 g/L,粗蛋白量為36.1%(菌干重),單細(xì)胞蛋白產(chǎn)量達(dá)到1.18 g/L。乳清廢水中COD和BOD5去除率分別達(dá)到67.6%和63.2%。

大豆乳清廢水;單細(xì)胞蛋白;產(chǎn)朊假絲酵母

0 引 言

大豆分離蛋白多用傳統(tǒng)“堿溶酸沉法”生產(chǎn),而目前困擾企業(yè)的最大問(wèn)題是其副產(chǎn)物——大豆乳清廢水,直接排放會(huì)造成環(huán)境污染[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),每生產(chǎn)1 t大豆分離蛋白需排放10 t高濃度大豆乳清廢水[2-3]。大豆乳清廢水含固形物約2%,富含乳清蛋白、大豆低聚糖、少量大豆異黃酮、皂甙等生物有機(jī)成分,其中COD和BOD均高于1萬(wàn),是寶貴的生物資源。酵母菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,蛋白含量較高(50%),具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、菌體大、易收集、價(jià)格便宜等特性,是生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP)的良好菌種[4]。目前,世界蛋白資源嚴(yán)重缺乏,單細(xì)胞蛋白已成為現(xiàn)代食品工業(yè)和飼料工業(yè)的主要蛋白來(lái)源。

利用廢棄資源發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白,前人已有相關(guān)研究。王有樂(lè)[5]、雷曉燕[6]等用產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵淀粉生產(chǎn)廢液,發(fā)酵后SCP得量較大,且淀粉廢液COD明顯降低。徐抗震等[7]以蘋(píng)果渣混合菌發(fā)酵生產(chǎn)SCP,確定了菌種最佳混合比。劉啟富等[8]也用酵母菌處理工業(yè)廢水,并對(duì)獲得的SCP進(jìn)行了氨基酸分析,得到較為理想的蛋白質(zhì)。為了解決企業(yè)難題,回收可利用生物資源,本研究直接用大豆乳清廢水培養(yǎng)酵母菌生產(chǎn)SCP,從而達(dá)到既獲得優(yōu)質(zhì)蛋白飼料,產(chǎn)生良好經(jīng)濟(jì)效益,又能大幅度降低廢水有機(jī)成分,減小環(huán)境污染等目的。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 發(fā)酵液原料

利用堿提酸沉法,模擬大豆分離蛋白生產(chǎn)過(guò)程,實(shí)驗(yàn)室制備大豆乳清廢水[9]。

1.1.2 菌 種

熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)2.587,產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)2.120,白地霉(Geotrichum candidum)2.498,白假絲酵母(Candida albicans)2.538,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2.109,皺褶假絲酵母(Candida rugosa)2.1378,藍(lán)莓酵母和核酸酵母等均由大連工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基[10]:酵母膏1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,自然p H,固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂, 121℃滅菌15 min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備

菌種活化:保藏菌種接種傳代,挑取單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)24 h,再按2%重新接種后于28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)至渾濁。

菌懸液:菌液經(jīng)4 000 r/min離心15 min后收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,稀釋成OD600為0.3的菌懸液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

菌懸液按2%接種量接種到大豆乳清廢水中,28℃、150 r/min培養(yǎng)10 h。

1.2.3 種子培養(yǎng)

將活化菌接種于YEPD液體培養(yǎng)基中,于28℃、150 r/min進(jìn)行培養(yǎng),繪制菌落生長(zhǎng)曲線以確定種子培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.4 產(chǎn)單細(xì)胞蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化

將種子液接種于大豆乳清廢水中,在不同接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3檢測(cè)方法

利用恒重法[11]測(cè)定菌體量。收集菌體,生理鹽水洗3次后于105℃烘干至恒重。

利用分光光度法[12]測(cè)定培養(yǎng)液OD600,計(jì)算菌濃度。

利用Folin-酚法[13]測(cè)定單細(xì)胞蛋白含量。離心收集菌體,加等體積水制成菌懸液,熱堿法破壁溶出蛋白后測(cè)定蛋白含量[14]。

利用凱氏定氮法[15]測(cè)定單細(xì)胞蛋白;利用重鉻酸鉀法[16]測(cè)定COD;利用稀釋與接種法[17]測(cè)定BOD5。

2 結(jié)果與分析

2.1大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白菌種的篩選

經(jīng)檢測(cè),大豆乳清廢水作為高濃度有機(jī)廢水,其COD可高達(dá)40 000 mg/L以上,可生化系數(shù)(B/C=BOD5/COD)大于0.4(0.3為可生化降解下限),廢水營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足,微生物可充分生長(zhǎng)利用?？紤]到產(chǎn)朊假絲酵母蛋白質(zhì)含量高,在不需任何生長(zhǎng)因子、只需少量氮源的條件下,能利用廢液大量生長(zhǎng),易于制備單細(xì)胞蛋白;白地霉?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高,繁殖速度快,能利用多種碳源,細(xì)胞形體大,易回收分離,可供食用及飼料用[18-19]。本研究在不添加其他營(yíng)養(yǎng)成分的前提下,直接利用大豆乳清廢水發(fā)酵8種酵母菌,各菌體產(chǎn)量以及單細(xì)胞蛋白含量結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌種利用大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(P＜0.05)Fig.1 Different strains producing single cell protein with soybean whey waste water(P＜0.05)

如圖1所示,產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)最好,菌體產(chǎn)量最高為3.18 g/L,自身蛋白含量達(dá)到30.24% (蛋白質(zhì)量/菌干重),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株,表明產(chǎn)朊假絲酵母能較好地利用大豆乳清廢水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。因此,選擇產(chǎn)朊假絲酵母作為發(fā)酵乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的優(yōu)勢(shì)菌。

2.2產(chǎn)朊假絲酵母的種子培養(yǎng)時(shí)間

由圖2可知,用YEPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母0～4 h時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢,處于調(diào)整期; 5～10 h時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體濃度明顯上升,菌體生長(zhǎng)力旺盛;10～14 h菌體濃度無(wú)明顯變化, 14 h時(shí)出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象,但生長(zhǎng)緩慢。這是由于產(chǎn)朊假絲酵母為兼性厭氧菌,在相對(duì)好氧條件下碳源耗盡后,酵母就會(huì)重新利用所產(chǎn)生的乙醇氧化生成二氧化碳和水[20]。此后,菌體生長(zhǎng)緩慢且在22 h后衰退。因此選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的產(chǎn)朊假絲酵母作為種子,確定種子培養(yǎng)時(shí)間為8 h。

圖2 產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of Candida utilis

2.3不同接種量對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響

研究表明,隨著菌體濃度的增加,單細(xì)胞蛋白的含量也逐漸增大,因此可通過(guò)檢測(cè)菌體濃度來(lái)間接反映單細(xì)胞含量的多少。由圖3可知,接種量從2%提升到5%時(shí),菌體濃度增加,達(dá)到OD600為0.835;接種量超過(guò)5%時(shí),菌體濃度變化不大,且無(wú)顯著性差異。因此,適宜的接種量決定菌體初始活力,并使菌體快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,縮短生產(chǎn)周期。故選擇5%接種量作為最適接種量。

圖3 接種量對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響(P＜0.05)Fig.3 Effect of inoculum concentration on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

2.4不同裝液量對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響

由圖4可知,隨著大豆乳清廢水裝液量的增加,菌體濃度下降。這是由于培養(yǎng)液越多,溶解氧量越少,因而相應(yīng)通氣量越小。由此可見(jiàn),產(chǎn)朊假絲酵母為好氧菌。因此,為獲得大量菌體應(yīng)盡量減少裝液量以獲得更多的溶解氧。當(dāng)裝液量為20%時(shí),菌體OD600達(dá)到0.952?？紤]到產(chǎn)量,裝液量不能過(guò)低,故選擇20%為最適裝液量。

圖4 裝液量對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響(P＜0.05)Fig.4 Effect of broth volume on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

2.5不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響

由圖5可知,在28和30℃培養(yǎng)溫度下,產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)情況較好,菌體OD600分別達(dá)到1.008和1.007,均高于26和32℃的菌濃度,綜合考慮能耗因素,確定28℃為產(chǎn)朊假絲酵母利用大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最適培養(yǎng)溫度。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響(P＜0.05)Fig.5 Effect of temperature on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

2.6不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響

由圖6可知,利用大豆乳清廢水發(fā)酵產(chǎn)朊假絲酵母,18 h后菌體OD持續(xù)增加,22 h時(shí)達(dá)到最大值1.005。到24 h時(shí)無(wú)明顯變化,且22和24 h菌體濃度無(wú)顯著性差異。為了縮短生產(chǎn)周期,選擇22 h為產(chǎn)朊假絲酵母的最適培養(yǎng)時(shí)間。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的影響(P＜0.05)Fig.6 Effect of fermentation time on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

3 結(jié) 論

本研究直接用大豆乳清廢水(不外加其他任何營(yíng)養(yǎng)成分)作培養(yǎng)基,從熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、白假絲酵母、白地霉、藍(lán)莓酵母、核酸酵母、釀酒酵母以及褶皺假絲酵母中,篩選出產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最優(yōu)菌種,為產(chǎn)朊假絲酵母,并優(yōu)化大豆乳清廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的條件,確定最優(yōu)條件為:裝液量20%、接種量5%、28℃培養(yǎng)22 h。在此條件下大豆乳清廢水發(fā)酵菌體干重產(chǎn)量達(dá)3.26 g/L,粗蛋白達(dá)36.1%(菌干重),單細(xì)胞蛋白干重產(chǎn)量為1.18 g/L。

用產(chǎn)朊假絲酵母處理大豆乳清廢水后,COD和BOD5分別降低67.6%和63.2%,說(shuō)明產(chǎn)朊假絲酵母處理大豆乳清廢水能力較強(qiáng)。若要更大限度地降低大豆乳清廢水直接排放對(duì)環(huán)境造成的污染,建議采用流加連續(xù)發(fā)酵方式,以達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)。由此可見(jiàn),不僅大豆乳清廢水,其他食品工業(yè)廢水也可被資源化利用,作為微生物發(fā)酵的良好原料生產(chǎn)SCP等產(chǎn)品。

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Production of single-cell protein with soybean whey waste water

WEN Zijian, QIAN Fang, TUO Yanfeng, JIANG Shujuan, MU Guangqing
(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

According to the characteristics of soybean whey waste water,Candida tropicalis,Candida utilis,Candida albicans,Candida rugosa,Geotrichum candidum,Blueberry yeast,nucleic acid yeast and Saccharomyces cerevisiae were selected for single-cell protein production,in which the yield of C.utilis was the highest.The culture condition in soybean whey wastewater for C.utilis was optimized.The results showed that the yeast yield,crud protein content and production of single cell protein could reach to 3.26 g/L,36.1%(dry weight)and 1.18 g/L respectively when the volume was 20%,inoculum was 5%,temperature was at 28℃,and culture time was 22 h.In those conditions, removal rate of COD and BOD5was up to 67.6%and 63.2%respectively.

soybean whey waste water;single-cell protein;Candida utilis

TS219

:A

文章編號(hào):1674-1404(2015)05-0313-04

2015-04-08.

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD18B04);國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心資助項(xiàng)目(2012FU125X03);遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2013229027);遼寧省高等學(xué)校重大科技平臺(tái)項(xiàng)目(2011191);遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(LR2013024).

溫子健(1991-),男,碩士研究生;通信作者:錢方(1966-),女,教授.