農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

王迅婧， 倪秀珍

(1.長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032；2.吉林省圖們市第二中學(xué)，吉林 延邊 133100)

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農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

王迅婧1,2， 倪秀珍1

(1.長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130032；2.吉林省圖們市第二中學(xué)，吉林 延邊 133100)

以裸燕麥白燕10號為材料，綠色熒光蛋白為報告基因，建立并優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系，并通過熒光顯微鏡及PCR方法分別檢測燕麥愈傷組織及再生苗中的目的基因。研究結(jié)果表明，農(nóng)桿菌菌體濃度OD600=0.5～0.8,侵染10 min時侵染效率最高，侵染7 d后燕麥愈傷組織可檢測到綠色熒光蛋白。PCR檢測結(jié)果表明，接近60% 的再生苗在基因組水平可檢測到GFP基因。

燕麥；遺傳轉(zhuǎn)化；GFP；PCR檢測

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是了解植物基因功能,改善植物性狀的一種生物學(xué)技術(shù)，通過遺傳轉(zhuǎn)化制備轉(zhuǎn)基因植物可以提高作物抗性及產(chǎn)量[1-3]。中國吉林省西部土壤鹽堿化嚴(yán)重，制約著該省西部農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人民生活水平的提高。自1998年起，中國和加拿大兩國專家合作培育出了能生長在鹽堿土壤、風(fēng)沙、干旱等環(huán)境的10個燕麥新品系。燕麥的根能夠吸收鹽堿地中的鹽分并將其儲存在燕麥秸稈中，通過多次種植燕麥可降低土壤含鹽量和PH值，因此燕麥?zhǔn)歉纳汽}堿地土壤環(huán)境的優(yōu)良作物[4-5]。通過遺傳轉(zhuǎn)化手段將來源于其它植物(例如羊草和蘆葦)的抗逆基因轉(zhuǎn)入燕麥，使這些基因在燕麥中穩(wěn)定表達(dá)，可提高燕麥的抗旱和抗鹽堿能力，是進(jìn)一步提高燕麥產(chǎn)量，擴(kuò)大燕麥種植面積及改良重度鹽堿地的1條有效途徑[6-8]。本研究以白燕10號成熟胚作為外植體，以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，建立并優(yōu)化了燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步提高燕麥抗逆品質(zhì)及改良中國西部土壤環(huán)境提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白燕10號裸燕麥種子由白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈；農(nóng)桿菌EHA105及帶有GFP基因的質(zhì)粒由長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存。

植物基因組提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，瓊脂糖為西班牙原裝進(jìn)口。

試驗中所用乙醇、升汞、潮霉素、羧芐青霉素、卡那霉素、利福平、2,4-D、IAA、6-BA、NAA、蔗糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl均為國產(chǎn)分析純試劑。LB固體(液體)培養(yǎng)基及MS培養(yǎng)基均經(jīng)過121 ℃高壓滅菌。

根據(jù)質(zhì)粒pCAMBIA1304中GFP堿基序列設(shè)計PCR引物，由上海生物工程有限公司合成：

引物1：5’-GGA GAA GAA CTT TTC ACT GGA G-3’；引物2：5’-TTA CCT GTC CAC ACA ATC TGC-3’。

1.2 方法

1.2.1 目的質(zhì)粒pCAMBIA1304-GFP的轉(zhuǎn)化及鑒定 將目的質(zhì)粒pCAMBIA1304-GFP通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞中，在終質(zhì)量濃度50 mg·L-1卡那、50 mg·L-1的利福平的固體LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12～16 h，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那、50 mg·L-1的利福平)中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并鑒定目的基因GFP。

1.2.2 農(nóng)桿菌菌體工作液濃度的優(yōu)化 收集含GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105，5000 g·min-1離心棄上清，加入液體 MS 誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+2，4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1)重懸，使菌體侵染液OD600值分別為0.3、0.5、0.8、1.0和1.5，用于侵染燕麥愈傷組織[9,10]，每個試驗4 個重復(fù)，每次處理20 個愈傷組織。經(jīng)過繼代培養(yǎng)(MS培養(yǎng)基中添加25 mg·L-1的潮霉素和350 mg·L-1的羧芐青霉素)統(tǒng)計轉(zhuǎn)化后燕麥愈傷組織再生率。

(1)

1.2.3 菌體侵染時間的優(yōu)化 將燕麥愈傷組織浸于OD600=0.5的農(nóng)桿菌侵染液中，分別侵染5、10、15、20 min，再分別接種到終濃度為200 μmol·L-1的乙酰丁香酮共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d 后轉(zhuǎn)接到含有(25 mg·L-1的潮霉素和350 mg·L-1的羧芐青霉素)抗生素的分化培養(yǎng)基中(MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1)，每個試驗 4 個重復(fù)，每次處理 20 個愈傷組織。期間統(tǒng)計不同侵染時間愈傷組織再生率。

1.2.4 轉(zhuǎn)化后愈傷組織分子生物學(xué)檢測 pCAMBIA1304中GFP基因的啟動子為組成型啟動子CaMV35S，侵染燕麥愈傷組織 7 d 后利用熒光顯微鏡(AE301)觀察愈傷組織，確定綠色熒光蛋白是否表達(dá)，試驗以未轉(zhuǎn)化的燕麥愈傷組織為陰性對照。

1.2.5 燕麥再生植株基因組水平上GFP基因的檢測 根據(jù)植物基因組提取試劑盒方法提取燕麥基因組DNA，利用PCR方法對GFP基因進(jìn)行鑒定，試驗以重組質(zhì)粒作為陽性對照，以去離子水作為空白對照，以未轉(zhuǎn)化的燕麥植株基因組作為陰性對照，并用以下公式計算轉(zhuǎn)化效率。

(2)

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃，3 min； 94 ℃，50 s； 52 ℃，50 s； 72 ℃，50 s；30 個循環(huán)； 72 ℃， 8 min。

1.2.6 燕麥再生植株轉(zhuǎn)錄水平上GFP基因的檢測 根據(jù)試劑盒提取步驟提取燕麥再生苗總RNA，利用RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平檢測GFP基因。試驗以重組質(zhì)粒作為陽性對照，以去離子水作為空白對照，以未轉(zhuǎn)化的燕麥植株基因組作為陰性對照。PCR擴(kuò)增條件為： 94℃, 3 min; 94℃ 50 s; 52 ℃ 50 s; 72 ℃, 50 s; 30個循環(huán); 72 ℃，8 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌EHA105中目的質(zhì)粒pCAMBIA1304-GFP的鑒定

用凍融法將質(zhì)粒pCAMBIA1304轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，挑取篩選培養(yǎng)基(含有卡那霉素和利福平)上的單克隆菌落，提取質(zhì)粒并通過PCR法鑒定目的基因GFP，目的質(zhì)粒圖譜及PCR鑒定結(jié)果如圖1所示。

2.2 農(nóng)桿菌侵染濃度的優(yōu)化

利用不同菌體濃度侵染燕麥愈傷組織，統(tǒng)計不同菌液濃度侵染后的植株再生率，試驗統(tǒng)計結(jié)果表明，當(dāng)菌體侵染濃度OD600=0.5時燕麥愈傷組織的再生率最高，結(jié)果見圖2。

2.3 農(nóng)桿菌侵染時間的優(yōu)化 選擇OD600=0.5的菌體濃度分別侵染燕麥愈傷組織5、10、15和20 min,侵染后統(tǒng)計不同侵染時間的植株再生率，實驗結(jié)果表明侵染10min的燕麥愈傷組織再生率最高，試驗結(jié)果如圖3所示。

注：M，Marker DL 2000；1，GFP基因的PCR鑒定結(jié)果。

2.4 愈傷組織及再生苗的分子生物學(xué)檢測

2.4.1 綠色熒光蛋白GFP的檢測 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化燕麥愈傷組織7 d后，將轉(zhuǎn)化的愈傷組織和非轉(zhuǎn)化的愈傷組織分別做成切片，在熒光顯微鏡(10×40倍)下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示：a、b為非轉(zhuǎn)化的愈傷組織細(xì)胞，在熒光下沒有看到綠色熒光；d為轉(zhuǎn)化后的燕麥愈傷組織細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可以清楚地看到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，可以初步證明轉(zhuǎn)化成功。

圖2 不同農(nóng)桿菌濃度侵染的燕麥愈傷組織分化率

圖3 不同時間侵染的燕麥愈傷組織分化率

注：a1:光學(xué)顯微鏡下非轉(zhuǎn)化的燕麥愈傷組織細(xì)胞(×400),a2: 與a1同視野內(nèi)熒光顯微鏡下非轉(zhuǎn)化的燕麥愈傷組織細(xì)胞(×400);b1:光學(xué)顯微鏡下轉(zhuǎn)化后的燕麥愈傷組織細(xì)胞(×400),b2: 與b1同視野內(nèi)熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)化后的燕麥愈傷組織細(xì)胞(×400)。

Note： a1: Oat callus cells of non-transformation detected by optical microscpe (×400), a2: Oat callus cells of non-transformation detected by fluorescence microscpe (×400); b1: Oat callus cells of transformation detected by optical microscpe (×400), b2: Oat callus cells of transformation detected by fluorescence microscope (×400).

圖4 愈傷組織中綠色熒光蛋白的檢測結(jié)果

Fig.4 GFP detected results of oat callus

2.4.2 燕麥再生苗基因組DNA的PCR檢測 提取轉(zhuǎn)化后燕麥再生植株基因組DNA，并以此DNA作為模板檢測GFP基因[11]，試驗共檢測132株再生苗，其中78株再生苗的GFP檢測呈陽性，轉(zhuǎn)化率接近60%，試驗結(jié)果如圖5所示(僅顯示6株再生苗的鑒定結(jié)果)。

注：M，DNA Marker DL 2 000；+，質(zhì)粒對照；-，非轉(zhuǎn)化對照植株；0，以水作為的空白對照;1～6，再生植株檢測結(jié)果。

Note： M，DNA Marker DL 2 000;+，Postive vector; -，Control plant of non-transformation; 0，H2O for blank; 1 to 6，Regeneration seedlings of transformation.

圖5 再生植株的PCR檢測結(jié)果

Fig.5 PCR results of regeneration seedlings

3 結(jié)論與討論

利用農(nóng)桿菌侵染法對植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化是一種操作相對簡單、費(fèi)用較低的方式，但不同作物及品種所需條件各異。本試驗結(jié)果表明，農(nóng)桿菌工作液濃度及處理時間是影響轉(zhuǎn)化后植株再生率的關(guān)鍵因素，當(dāng)菌體工作液濃度OD600為0.5時，愈傷組織產(chǎn)生再生苗的數(shù)目最高，當(dāng)工作液濃度過高時一方面會導(dǎo)致麥愈傷組織褐化，另一方面會使抑菌困難，嚴(yán)重污染培養(yǎng)基；在菌體工作液濃度OD600為0.5的條件下，侵染愈傷組織10 min時，燕麥植株再生率最高，侵染時間過短會降低侵染效率致使愈傷組織在篩選過程中降低再生率，而侵染時間過長一方面會對愈傷組織造成傷害引起褐化，另外一方面不利于后期培養(yǎng)過程中抑制農(nóng)桿菌的生長。 轉(zhuǎn)化7 d后綠色熒光蛋白(GFP)在愈傷組織中表達(dá)，再生植株基因組水平檢測陽性率可達(dá)60%，本研究所建立的高效的燕麥遺傳轉(zhuǎn)化體系為進(jìn)一步研究燕麥提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：李 瑩)

Establishment of an agrobacterium mediated genetic transformation system for oat (AvenuenudaL.)

WANG Xunjing1,2， NI Xiuzhen1

(1.Department of Biology, Changchun Normal University, Changchun 130032, China； 2.No.2 Middle School of Tumen, Yanbian 133100, China)

Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring the plasmid pCAMBIA1304-GFP was used to transform oat (Baiyan 10)derived mature embryo, and fluorescence microscope and PCR method were used to detect the target gene in the embryogenic calluses and regenerated plants. The experiment results showed that the mature embryo infiltrated with bacterial suspensions (OD600=0.5～0.8) for 10 min was the best condition, the GFP can be detected in the embryogenic calluses by the fluorescence microscope after one week of infiltration, and about 60% regenerated plants were positive by PCR test.

oat； genetic transformation； GFP； PCR test

2014-08-25

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130102063JC)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(2013-258)；長春師范大學(xué)自然科學(xué)基金項目 (2011D010)

王迅婧(1984-)，女，吉林延邊人，碩士研究生，主要從事植物與植物分子生物學(xué)研究。

倪秀珍(1967-)，女，吉林長春人，教授，博士。

1000-2340(2015)04-0457-04

Q 819

A