早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)及植株再生體系的建立

李俊強(qiáng)，林利華，張 帆，萬(wàn)雪琴，劉 敏，趙景龍

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都611130；2．宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644000）

早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)及植株再生體系的建立

李俊強(qiáng)1，2，林利華2，張 帆1*，萬(wàn)雪琴1，劉 敏1，趙景龍1

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都611130；2．宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644000）

以野生早開(kāi)堇菜為材料，研究了不同外植體類(lèi)型（子葉節(jié)、葉片、葉柄）和不同激素配比對(duì)其不定芽誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響，成功建立了早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)植株再生體系。結(jié)果表明，1）誘導(dǎo)子葉節(jié)和葉柄不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS＋2．0 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA，葉片不適合作為直接誘導(dǎo)不定芽的外植體。2）3種外植體均能誘導(dǎo)愈傷組織，子葉節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)的時(shí)間最短，其次為葉柄，葉片最晚。子葉節(jié)和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D，誘導(dǎo)率分別為98．3%和96．7%；葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D＋0．05 mg／L NAA，誘導(dǎo)率可達(dá)88．3%。3）最適愈傷組織分化培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA，分化率為100%。4）不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA，增殖率為4．68。5）再生苗移植到添加1．0 mg／L 6-BA的1／2 MS培養(yǎng)基上，生根率92．3%。6）組培苗移栽到珍珠巖∶河沙∶腐殖質(zhì)（1∶2∶2）的混合基質(zhì)時(shí)，100%成活，且植株長(zhǎng)勢(shì)好。

早開(kāi)堇菜；組織培養(yǎng)；植株再生

早開(kāi)堇菜（Viola prionantha）又名早花地丁，屬堇菜科堇菜屬多年生草本植物，分布于我國(guó)東北、華北、陜西、甘肅、湖北、四川、云南以及朝鮮和西伯利亞等地［1］。早開(kāi)堇菜植株低矮、花期長(zhǎng)、花色艷麗、花型美觀、株型雅致，具有較高的觀賞價(jià)值，可用于地被綠化、花境綠化、綴花草坪綠化之中；其次早開(kāi)堇菜具有適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)、競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)等特點(diǎn)使其具有廣闊的園林開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景［2-3］。張金政等［3］在推薦具有良好的景觀效果和適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的優(yōu)良花卉資源時(shí)，就重點(diǎn)推薦了早開(kāi)堇菜。此外，早開(kāi)堇菜具有較高的藥用價(jià)值，能清熱解毒，有強(qiáng)的抗菌活性，其抗菌作用比同屬的紫花地?。╒.philippica）還要強(qiáng)［4-5］。已有學(xué)者對(duì)早開(kāi)堇菜的藥性成分進(jìn)行過(guò)研究，研究結(jié)果表明早開(kāi)堇菜揮發(fā)油中含44種化學(xué)成分；這些成分具有防霉、防腐、消炎殺菌、抗腫瘤、抗突變、增強(qiáng)免疫功能等多方面功能［6］。早開(kāi)堇菜主要靠種子繁殖和根狀莖繁殖，但上述兩種繁殖方式的繁殖率都比較低，不能滿足作為地被植物和藥用植物用量大的需求。

近年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)早開(kāi)堇菜的資源概況［7］、生理特性［8］、藥用特性［9-10］以及對(duì)重金屬富集吸收特性［11-13］等方面進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)其再生體系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。早開(kāi)堇菜作為早春開(kāi)花的優(yōu)良地被植物，目前還沒(méi)有被廣泛應(yīng)用；野生資源是早開(kāi)堇菜藥用的主要來(lái)源，但由于過(guò)度采挖導(dǎo)致現(xiàn)階段該物種資源逐年減少。早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，益于該物種資源的有效保護(hù)、再生利用和持續(xù)發(fā)展；而且還能通過(guò)植物組織培養(yǎng)的快速繁殖滿足城市園林綠化對(duì)地被植物需求量大的要求。因此，亟待建立早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)植株再生體系。本研究以早開(kāi)堇菜的子葉節(jié)、葉片和葉柄為外植體，成功建立了完整的早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)植株再生體系，為這一野生資源的保護(hù)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 植物材料

野生早開(kāi)堇菜（圖1A）成熟種子于2013年6月采自四川省雅安市（北緯30．3°，東經(jīng)103．0°）。外植體為種子繁殖幼苗的子葉節(jié)、葉片和葉柄。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 外植體處理及消毒 1）子葉節(jié)處理：選取早開(kāi)堇菜飽滿的新鮮種子，放在培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫箱中進(jìn)行催芽。待胚根長(zhǎng)出1 cm左右，子葉恰好脫離種皮時(shí)的幼苗為試材。流水沖洗1 h，然后在1 g／L的多菌靈溶液中浸泡20 min，沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)上70%的酒精中浸泡15 s，無(wú)菌水沖洗2次，再放入0．1%的升汞中消毒5～6 min，無(wú)菌水沖洗5次，每次2 min以上，最后用無(wú)菌紗布吸干表面水分，備用。

2）葉片、葉柄處理：選擇健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良植株，剪取帶葉柄的幼嫩葉片，于洗衣粉中浸泡20 min，用毛刷輕輕刷去葉片、葉柄上殘留的臟物，再用流水沖洗2～3 h，然后放入1 g／L的多菌靈溶液中浸泡30 min，流水沖洗干凈之后置于超凈工作臺(tái)上70%酒精中浸泡30 s，后用無(wú)菌水沖洗2次，再放入0．1%的升汞中消毒8 min，無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌紗布吸干表面水分，備用。

1．2．2 子葉節(jié)、葉片和葉柄誘導(dǎo)不定芽 滅菌完成后，置于超凈工作臺(tái)上，用解剖刀切取整個(gè)子葉節(jié)，下胚軸留約0．3 cm［14］；將葉柄剪成0．5～1．0 cm左右的節(jié)段，葉片剪成1．0 cm×1．0 cm大小，接種于培養(yǎng)基上。以MS＋3．0%蔗糖＋0．7%瓊脂為基本培養(yǎng)基分別添加不同濃度的6-芐氨基嘌呤（6-BA：1．0，1．5，2．0 mg／L）、萘乙酸（NAA：0．05，0．10，0．50 mg／L）。采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理接種20個(gè)外植體，每處理重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率以及出芽指數(shù)［15］。

1．2．3 子葉節(jié)、葉片、葉柄愈傷組織的誘導(dǎo) 以MS＋3．0%蔗糖＋0．7%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0．5，1．0，1．5 mg／L）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D：0．05，0．10，0．50 mg／L）、NAA（0．05，0．10，0．50 mg／L）為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后將滅完菌的外植體接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。該試驗(yàn)采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理接種20個(gè)外植體，每處理重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)情況以及出愈率。

1．2．4 愈傷組織不定芽的分化 將誘導(dǎo)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，使愈傷組織分化成苗。分化培養(yǎng)基為：以MS＋3．0%蔗糖＋0．7%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（0，1．0，1．5，2．0 mg／L）、NAA（0，0．05，0．075，0．10 mg／L）。采用完全試驗(yàn)組合，每個(gè)處理20瓶，每瓶接種直徑1．0 cm的愈傷組織，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率及平均不定芽數(shù)。

1．2．5 不定芽的增殖培養(yǎng) 將由愈傷組織分化而來(lái)的不定芽或者由外植體直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽切割成單芽，在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，30 d繼代一次，記錄增殖芽數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)，篩選出最佳增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基：1）MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA；2）MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA，每個(gè)處理20株苗，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)芽的增殖情況。

1．2．6 有效苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng) 于不添加激素的MS培養(yǎng)基中直接接種小苗，15 d后統(tǒng)計(jì)有效苗率（苗高＞4 cm），并觀察有效苗的生長(zhǎng)情況。選擇4 cm以上的健壯早開(kāi)堇菜有效單苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別以MS、1／2 MS、1／4 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（0，0．5，1．0 mg／L）、NAA（0，0．3，0．5 mg／L）為生根培養(yǎng)基。試驗(yàn)采用3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理20瓶，每瓶1株單苗，各處理重復(fù)3次。40 d后統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)。

1．2．7 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基p H 5．7～6．0，培養(yǎng)溫度恒定保持（25±2）℃，光照強(qiáng)度為25～35μmol／（m2·s），光照時(shí)間16 h／d。

1．2．8 煉苗與移栽 待苗根長(zhǎng)2 cm，苗高5～6 cm時(shí)，在封口膜上密刺小孔，于溫室散射光下培養(yǎng)，第4天揭開(kāi)1／4的封口膜，第7天揭開(kāi)1／2封口膜，第10天將封口膜全部揭開(kāi)，第13天將試管苗輕輕取出，洗凈根部的殘留培養(yǎng)基，移植到基質(zhì)上。選用珍珠巖、河沙、腐殖質(zhì)按一定比例（1∶1∶3，1∶2∶2，2∶2∶1）混合成混合基質(zhì)。

煉苗前，使用0．1%的高錳酸鉀對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒處理。苗栽后澆透水一次，初期可加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)，溫度保持20～30℃，濕度保持80%以上。每種基質(zhì)移栽20株，重復(fù)3次，期間觀察幼苗生長(zhǎng)情況，20 d后統(tǒng)計(jì)成活率（%）。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用EXCEL 2003和SPSS 17．0進(jìn)行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不定芽誘導(dǎo)

2．1．1 外植體的類(lèi)型對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響 3種外植體直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的難易程度不同（表1），子葉節(jié)最容易誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，其誘導(dǎo)率最高可達(dá)96．7%、出芽指數(shù)為4．22，其次是葉柄，最高誘導(dǎo)率83．3%、出芽指數(shù)為3．02，最低為葉片，誘導(dǎo)率僅為35．0%、出芽指數(shù)1．38。并且由葉片分化的芽長(zhǎng)勢(shì)差，容易褐化、死亡。因此利用早開(kāi)堇菜的子葉節(jié)和葉柄作為外植體直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽效果最好，不宜選用葉片誘導(dǎo)不定芽。

2．1．2 不同濃度激素配比對(duì)誘導(dǎo)芽的影響 由表1可以看出2，3，9號(hào)處理中，芽誘導(dǎo)率較高，分別為88．3%，96．7%，83．3%，不定芽生長(zhǎng)健康，呈現(xiàn)出嫩綠色或綠色（圖1B，C）。不同濃度的6-BA對(duì)出芽指數(shù)的影響是有顯著差異的，當(dāng)6-BA的濃度為2．0 mg／L時(shí)，誘導(dǎo)率和出芽指數(shù)最高，分別為71．6%，2．87。因此，促進(jìn)外植體直接成芽的最佳6-BA濃度為2．0 mg／L。另一方面，當(dāng)NAA的濃度為0．1 mg／L時(shí)，誘導(dǎo)率和出芽指數(shù)均達(dá)最大值，分別為58．9%，2．51。因此，從外植體上直接誘導(dǎo)芽的最佳的NAA濃度為0．1 mg／L。綜合數(shù)據(jù)分析，最有利于誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜子葉節(jié)和葉柄產(chǎn)生不定芽的最適的培養(yǎng)基為：MS＋2．0 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA。

2．2 愈傷組織誘導(dǎo)

2．2．1 不同濃度激素配比對(duì)子葉節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將早開(kāi)堇菜子葉節(jié)接種至不同濃度激素配比的培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)15 d后子葉節(jié)開(kāi)始膨大，然后光照培養(yǎng)7 d后開(kāi)始形成愈傷組織。由表2可以看出6號(hào)和3號(hào)處理中子葉節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別為98．3%和88．3%，且愈傷組織生長(zhǎng)健康，呈白色或乳白色緊密狀（圖1D）。6-BA、2，4-D、NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)呈顯著差異。當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA濃度為0．5和1．0 mg／L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率比較高，生長(zhǎng)狀態(tài)比較好，此后，隨著6-BA濃度增加到1．5 mg／L時(shí)，誘導(dǎo)率急劇下降，愈傷組織呈現(xiàn)出黃

色、褐色松軟狀，說(shuō)明高濃度的細(xì)胞分裂素不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。愈傷組織誘導(dǎo)率在一定范圍內(nèi)隨著2，4-D濃度的增加而升高，當(dāng)培養(yǎng)基中2，4-D濃度為0．5 mg／L時(shí)，誘導(dǎo)的效果最佳。NAA的濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響不顯著。因此根據(jù)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度宜低不宜高的原則［16］，誘導(dǎo)子葉節(jié)愈傷組織最適宜的培養(yǎng)基為：MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D。

表1 不同外植體類(lèi)型和激素濃度配比對(duì)芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different explants and various hormone rations on bud induction in V．prionantha

圖1 早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)植株再生體系Fig．1 Plant regeneration system via tissue in V．prionantha

表2 不同濃度激素配比對(duì)子葉節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of various hormone rations on callus induction of cotyledon node

2．2．2 不同濃度激素配比對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將早開(kāi)堇菜葉片接種至不同濃度激素配比的培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)15 d后葉片從切口處開(kāi)始膨大，光照培養(yǎng)15 d后葉片四周開(kāi)始形成愈傷組織，剛誘導(dǎo)出時(shí)生長(zhǎng)緩慢，多次繼代后生長(zhǎng)旺盛。

表3 不同濃度激素配比對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of various hormone rations on callus induction of leaf blade

由表3可以看出在葉片愈傷組織誘導(dǎo)中，6-BA、2，4-D、NAA 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響呈顯著差異。當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA濃度增加到1．5 mg／L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率急劇下降；而葉片愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增加而升高；不同濃度NAA對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響無(wú)顯著差異。

6號(hào)和3號(hào)處理中葉片愈傷組織誘導(dǎo)率較高，兩者的差異不顯著，分別為88．3%和83．3%，愈傷組織生長(zhǎng)健康，呈白色或乳白色緊密狀（圖1E）。當(dāng)6-BA、2，4-D、NAA濃度分別為1．0，0．50和0．05 mg／L時(shí)，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)88．3%。因此，誘導(dǎo)葉片愈傷組織最適宜的培養(yǎng)基為：MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D＋0．05 mg／L NAA。

2．2．3 不同濃度激素配比對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將早開(kāi)堇菜葉柄接種至不同濃度激素配比的培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)15 d后葉柄從切口處開(kāi)始膨大，光照培養(yǎng)7 d后葉柄兩端及表面形成大量愈傷組織。由表4可以看出6號(hào)處理和3號(hào)處理中葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別為96．7%和88．3%，愈傷組織生長(zhǎng)健康，呈白色或乳白色緊密狀（圖1F）。

6-BA、2，4-D、NAA 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)呈顯著差異。當(dāng)6-BA的濃度為1．5 mg／L時(shí)，葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率最低，并且愈傷組織呈松軟狀，說(shuō)明高濃度的細(xì)胞分裂素不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。此外不同濃度的NAA對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異不顯著，根據(jù)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度宜低不宜高的原則，誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜葉柄愈傷組織的最適NAA濃度為0 mg／L。因此，誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜葉柄愈傷組織最適培養(yǎng)基為：MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D。

表4 不同濃度激素配比對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 Effect of various hormone rations on callus induction of petiole

2．3 愈傷組織分化

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，15 d后愈傷組織開(kāi)始增殖，且逐漸由白色或乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，愈傷組織上陸續(xù)出現(xiàn)綠點(diǎn)。40 d后開(kāi)始有芽的分化，50 d后芽開(kāi)始大量分化（圖1I）。

由表5可以看出，單獨(dú)使用6-BA或NAA以及不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，愈傷組織不定芽分化率和平均不定芽數(shù)均為0，且愈傷組織逐漸褐化，變黃。當(dāng)6-BA濃度為1．5 mg／L，NAA濃度為0．1 mg／L時(shí)愈傷組織不定芽分化率最高，達(dá)100%，每塊愈傷組織的平均不定芽數(shù)達(dá)8．03。因此，誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA。

2．4 不定芽增殖

將產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，20 d后單芽基部相繼出現(xiàn)新芽。表6可以看出2號(hào)培養(yǎng)基：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA的不定芽增殖效果最好，苗綠、健壯（圖1G），增殖倍數(shù)達(dá)到6．72；其次為1號(hào)培養(yǎng)基：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA，增殖倍數(shù)達(dá)4．68。不定芽增殖培養(yǎng)中，適當(dāng)降低NAA濃度有利于提高單芽的增殖倍數(shù)。將所有單芽轉(zhuǎn)移到2號(hào)培養(yǎng)基上繼代增殖，芽的生長(zhǎng)狀態(tài)極佳。因此，早開(kāi)堇菜不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA。

表5 不同濃度激素配比對(duì)愈傷組織分化的影響Table 5 Effect of various hormone rations on callus differentiation

表6 不同濃度激素配比對(duì)不定芽增殖的影響Table 6 Effect of various hormone rations on adventitious bud proliferation

2．5 不同培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)組培苗生根的影響

直接將小苗轉(zhuǎn)接于不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中，15 d后有效苗率高達(dá)98．3%，有效苗植株生長(zhǎng)健壯，葉色嫩綠。將有效單苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，接種25 d左右，多數(shù)處理中的幼苗開(kāi)始生根，根系呈黃白色輻射狀（圖1J，K）。

由表7可以看出，6號(hào)處理的生根率最高、平均生根數(shù)最多、平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)，分別為92．3%，5．4，4．8 cm。5號(hào)處理次之；而在沒(méi)有添加任何植物激素的1號(hào)處理中無(wú)根的分化。培養(yǎng)基的類(lèi)型對(duì)生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)均有顯著影響，1／2 MS培養(yǎng)基明顯優(yōu)于MS和1／4 MS培養(yǎng)基，因此早開(kāi)堇菜生根最適宜的基本培養(yǎng)基為1／2 MS培養(yǎng)基。不同激素對(duì)生根影響不同。生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)在一定的范圍內(nèi)隨著6-BA濃度的增加而升高。當(dāng)6-BA濃度為1．0 mg／L時(shí)，所有指標(biāo)均達(dá)到最大值，植物生長(zhǎng)良好，葉色嫩綠，葉片數(shù)多；NAA的濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，根據(jù)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度宜低不宜高的原則，NAA選擇最低濃度0 mg／L。綜合數(shù)據(jù)分析，最有利于早開(kāi)堇菜幼苗生根的培養(yǎng)基組合為：1／2 MS＋1．0 mg／L 6-BA。

2．6 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽的影響

待組培苗生長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)，開(kāi)蓋煉苗7 d后移植到1（珍珠巖）∶2（河沙）∶2（腐殖質(zhì)）的混合基質(zhì)上，植株成活率最高，生長(zhǎng)良好（表8）（圖1L）。

表7 不同培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)組培苗生根的影響Table 7 Effects of different culture medium and plant growth regulators combinations on rooting of the plants

3 討論

3．1 外植體類(lèi)型對(duì)早開(kāi)堇菜植株再生的影響

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物的種類(lèi)、同一植物生理狀態(tài)、生長(zhǎng)季節(jié)、器官和部位的不同，其再生能力是有差異的［17-19］。有研究者發(fā)現(xiàn)：芽的再生能力＞胚狀體再生能力＞愈傷組織再生能力＞營(yíng)養(yǎng)體組織再生能力［20］。鄒永梅和黃雪芳［21］以帶腋芽的萬(wàn)壽菊（Tagetes erecta）莖段為外植體在添加不同濃度的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽再生，其芽誘導(dǎo)率均超過(guò)90%，并建立了萬(wàn)壽菊莖段離體再生體系。齊廣勛等［22］以白三葉（Trifolium repens）子葉節(jié)為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生了優(yōu)質(zhì)的叢生芽。本研究以野生早開(kāi)堇菜子葉節(jié)、葉片、葉柄為外植體誘導(dǎo)芽，誘導(dǎo)率從高到低分別為子葉節(jié)、葉柄和葉片。葉片的誘導(dǎo)率最低，不適合作為直接誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜產(chǎn)生不定芽的外植體，其原因可能與葉片的分化程度有關(guān)；而子葉節(jié)和葉柄是誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜產(chǎn)生不定芽的最佳選擇。

表8 不同移栽基質(zhì)對(duì)組培苗成活率的影響Table 8 Effects of different transplanting substrates on seedling survival rate

3．2 基本培養(yǎng)基的類(lèi)型對(duì)早開(kāi)堇菜植株再生的影響

在植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，植物種類(lèi)不同其對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的要求也不同；甚至是同一植物不同培養(yǎng)階段，其所需的營(yíng)養(yǎng)成分也不盡相同。基本培養(yǎng)基是影響植物組織培養(yǎng)的重要因素，在選擇基本培養(yǎng)基時(shí)除依據(jù)植物的遺傳特性、生物及生態(tài)學(xué)特性以外，還應(yīng)考慮基本培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度、營(yíng)養(yǎng)元素的種類(lèi)等。一般來(lái)講，無(wú)機(jī)鹽濃度高，有利于植株的莖葉生長(zhǎng)，無(wú)機(jī)鹽濃度低，有利于根的生長(zhǎng)［23］。MS培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度高，且鉀離子和銨離子含量豐富，元素比例適當(dāng)，具有較強(qiáng)的緩沖性，能夠滿足快速增長(zhǎng)的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需求，是目前使用最廣的培養(yǎng)基［24］。早開(kāi)堇菜的組織培養(yǎng)表明：基本培養(yǎng)基是影響早開(kāi)堇菜生根的主導(dǎo)因素。1／2 MS培養(yǎng)基中早開(kāi)堇菜的生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)明顯優(yōu)于MS和1／4 MS培養(yǎng)基，這可能是因?yàn)榛九囵B(yǎng)基中N元素的濃度不同影響生根。Maene和Debergh［25］報(bào)道離體培養(yǎng)植物生根時(shí)，培養(yǎng)基中的鹽類(lèi)濃度減少會(huì)促進(jìn)植物的生根；López-Bucio等［26］在根系發(fā)育研究中提出，減少培養(yǎng)基中的N元素或增加P元素均可促進(jìn)根系發(fā)育與生長(zhǎng)。因此早開(kāi)堇菜生根最適宜的基本培養(yǎng)基為1／2 MS培養(yǎng)基。此外本實(shí)驗(yàn)前期的預(yù)試驗(yàn)表明，早開(kāi)堇菜的初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、愈傷組織分化培養(yǎng)以及壯苗培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

3．3 不同激素配比對(duì)早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)的影響

植物細(xì)胞分化和生長(zhǎng)方向主要受激素調(diào)控，不同激素配比能夠有效的控制植物形態(tài)建成的發(fā)展方向。細(xì)胞分裂素的主要作用是引起植物細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的形成和促進(jìn)芽的生長(zhǎng)；而生長(zhǎng)素主要促進(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)和根的分化。在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值決定著芽和根的分化。通常情況下，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值在1左右時(shí)，促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化；當(dāng)兩者的比值低時(shí)，促進(jìn)根的生長(zhǎng)；兩者的比值高時(shí)，則促進(jìn)芽的生長(zhǎng)［27］。本研究結(jié)果表明合理的6-BA、NAA以及2，4-D配比能有效誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜子葉節(jié)、葉片、葉柄產(chǎn)生不定芽及愈傷組織。本研究中1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D的激素配比是誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜子葉節(jié)和葉柄的愈傷組織的最適激素配比，其愈傷組織誘導(dǎo)率分別為98．3%，96．7%；而1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D＋0．05 mg／L NAA激素配比是誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜葉片愈傷組織的最適激素配比，其愈傷組織誘導(dǎo)率為88．3%；喬琦等［28］也在0．5 mg／L 2，4-D＋0．5 mg／L 6-BA以及1．0 mg／L 2，4-D＋0．2 mg／L 6-BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)了紫花地丁的愈傷組織，本研究與其結(jié)果基本一致，說(shuō)明同屬植物之間其生長(zhǎng)對(duì)激素的需求具有相似性。

NAA是植物組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素類(lèi)激素之一，在誘導(dǎo)愈傷組織分化時(shí)使用較多，其使用的濃度范圍是0．1～1．0 mg／L。本研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA濃度為0．1 mg／L時(shí)，早開(kāi)堇菜愈傷組織分化率最高，達(dá)100%。生長(zhǎng)素濃度低于細(xì)胞分裂素濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)植物芽的形成，且細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)作用，6-BA是促進(jìn)植物細(xì)胞分裂分化的激素，在愈傷組織分化中起主導(dǎo)作用，其濃度使用范圍為1．0～3．0 mg／L，本研究中發(fā)現(xiàn)1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA的激素配比是誘導(dǎo)早開(kāi)堇菜愈傷組織分化的最適激素配比，喬琦等［28］也在0．5 mg／L 2，4-D＋1．0 mg／L 6-BA的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)了紫花地丁的愈傷組織的分化，能有效再生成苗。本研究中早開(kāi)堇菜不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA。這與許多植物通過(guò)愈傷組織再生和外植體上直接發(fā)生芽的研究報(bào)道［29-31］基本一致，再次表明生長(zhǎng)素濃度低于細(xì)胞分裂素濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)植物芽的形成，且細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)作用。

許多植物組織培養(yǎng)的研究證實(shí)，無(wú)任何激素的1／2 MS培養(yǎng)基是組培苗生根的最適培養(yǎng)基，而且植物激素中生長(zhǎng)素濃度高于細(xì)胞分裂素的濃度時(shí)才有利于根的分化，而本研究中卻得到了相反的結(jié)果：在1／2 MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1．0 mg／L 6-BA最有利于早開(kāi)堇菜生根，生根率為92．3%。

4 結(jié)論

以早開(kāi)堇菜子葉節(jié)、葉柄為外植體，誘導(dǎo)其愈傷組織的最適培養(yǎng)基為：MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D；誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基為：MS＋2．0 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA；以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為：MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D＋0．05 mg／L NAA；愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA；不定芽增殖的最適培養(yǎng)基為：MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA；生根培養(yǎng)基為1／2 MS＋1．0 mg／L 6-BA；把組培苗移栽到1（珍珠巖）∶2（河沙）∶2（腐殖質(zhì)）的混合基質(zhì)上，全部成活。

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Tissue culture in vitro and plant regeneration of Viola prionantha

LI Jun-Qiang1，2，LIN Li-Hua2，ZHANG Fan1*，WAN Xue-Qin1，LIU Min1，ZHAO Jing-Long1
1.Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.Vocational and Technical College，Yibin 644000，China

The effects of various hormone ratios on adventitious buds，callus inductions and differentiation were investigated using the cotyledon node，leaf blade and petiole of Viola prionantha as explants．Finally，a plant regeneration system via tissue culture was established．The results showed that the optimal medium for adventitious bud induction from the cotyledon node and petiole was MS＋2．0 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA，but the leaf blade was not suitable as an explant．Three kinds of explants could induce callus formation．The optimal medium for callus induction from the cotyledon node and petiole was MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D with the highest callus induction rate being 98．3%and 96．7%，respectively．The optimal medium for callus induction from the leaf blade was MS＋1．0 mg／L 6-BA＋0．5 mg／L 2，4-D＋0．05 mg／L NAA with the highest callus induction rate being 88．3%．The best medium for callus differentiation was MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．1 mg／L NAA with the highest callus differentiation rate being 100%．The optimal medium for the proliferation of adventitious buds was MS＋1．5 mg／L 6-BA＋0．075 mg／L NAA，the highest proliferation times being 4．68．The rooting rate of regenerated plants was up to 92．3%on half strength MS medium supplemented with 1．0 mg／L 6-BA．Rooted plantlets were grown on mixture with perlite：sand：humus（1：2：2）；survival rate was upto 100%with good growth．

Viola prionantha；tissue cultural；plant regeneration

10．11686／cyxb2015160 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

李俊強(qiáng)，林利華，張帆，萬(wàn)雪琴，劉敏，趙景龍．早開(kāi)堇菜組織培養(yǎng)及植株再生體系的建立．草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（11）：163-173．

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2015-03-26；改回日期：2015-05-20

四川省“十二五”科技攻關(guān)項(xiàng)目林木新品種選育（2011YZGG）資助。

李俊強(qiáng)（1976-），男，四川宜賓人，副教授，博士。E-mail：379582780＠qq．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：nolady＠163．com