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      中華絨螯蟹點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

      2015-06-25 12:12:28曹海鵬溫樂(lè)夫白金尊
      關(guān)鍵詞:點(diǎn)狀產(chǎn)氣腸炎

      曹海鵬,溫樂(lè)夫,白金尊,張 帆,何 珊

      (上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心(ZF1206),上海201306)

      中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)肉味鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種之一,深受消費(fèi)者的青睞。近年來(lái),隨著中華絨螯蟹經(jīng)濟(jì)價(jià)值的日益顯現(xiàn),中華絨螯蟹市場(chǎng)需求量不斷增加,規(guī)?;B(yǎng)殖日益擴(kuò)大,其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在江蘇、安徽、湖北、浙江及北方的遼寧等主產(chǎn)地迅猛發(fā)展,年產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)了60余萬(wàn)噸,年產(chǎn)值已達(dá)400億元[1]。然而,由于養(yǎng)殖戶投飼不科學(xué)、水質(zhì)惡化等諸多因素,病害問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中,腸炎是目前嚴(yán)重影響我國(guó)中華絨螯蟹養(yǎng)殖發(fā)展的細(xì)菌性病害之一,但從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來(lái)看,中華絨螯蟹腸炎的研究基礎(chǔ)薄弱,未見(jiàn)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌引起的中華絨螯蟹腸炎及其防控藥物等方面研究的詳細(xì)報(bào)道。2014年8月,江蘇省泗洪縣一養(yǎng)殖戶池塘養(yǎng)殖的中華絨螯蟹出現(xiàn)了嚴(yán)重的腸炎,每天死亡量高達(dá)180多只,主要病癥為病蟹行動(dòng)遲緩,攝食減少或不攝食;剖檢可見(jiàn),腸道發(fā)炎,有膿狀黏液且無(wú)糞便,肝胰腺呈暗黃色。本研究從自然發(fā)病的中華絨螯蟹體內(nèi)分離鑒定病原菌,并進(jìn)一步分離鑒定菌株的分類地位與藥敏特性,以期為中華絨螯蟹腸炎的病原學(xué)研究與防控提供資料。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      患腸炎的中華絨螯蟹,12只,平均體重為62.3g,取自江蘇泗洪縣自然發(fā)病養(yǎng)殖池。

      1.2 方法

      1.2.1 病原菌的分離 選取具有典型發(fā)病癥狀的瀕死中華絨螯蟹,用750mL/L酒精表面消毒后常規(guī)無(wú)菌取其肝胰腺組織,分別在TCBS瓊脂平板和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線,30℃恒溫培養(yǎng)18h~24h后純化分離菌株,然后轉(zhuǎn)接到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2 分離菌株的人工回歸感染試驗(yàn) 選取無(wú)病傷、體質(zhì)健壯、大小均勻(平均體重為36.1g)的健康中華絨螯蟹進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)。試驗(yàn)共包括5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組試驗(yàn)中華絨螯蟹各10只。用無(wú)菌生理鹽水分別洗下培養(yǎng)基斜面上各分離菌株的菌苔,用稀釋涂布平板法測(cè)定并調(diào)節(jié)各菌懸液濃度為1.0×107CFU/mL,然后分別在健康中華絨螯蟹第3步足基部注射[2],每尾注射0.1mL,對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。連續(xù)6d觀察中華絨螯蟹的發(fā)病癥狀及死亡情況,發(fā)現(xiàn)死蟹及時(shí)撈出,解剖檢查其病變情況,同時(shí)對(duì)回歸感染發(fā)病瀕死的中華絨螯蟹肝胰腺組織進(jìn)行常規(guī)病原菌再分離。每組試驗(yàn)中華絨螯蟹各10只,水溫控制在為28℃。

      1.2.3 病原菌的鑒定

      1.2.3.1 生理生化鑒定 參照余銀春等[3]方法,用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

      1.2.3.2 分子鑒定 以病原菌株的基因組DNA為模板,對(duì)其16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中,正向引物為 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物為1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR的擴(kuò)增條件為:94 ℃3min;94℃1min,60℃1min,72℃1min,共35個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將測(cè)得序列用DNA Man軟件編輯后,在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中利用BLASTN軟件與Gen-Bank基因庫(kù)中已知的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較,選取同源性較高的序列并利用軟件BioEdit 7.0和MEGA 4.0進(jìn)行多重比較后通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

      1.2.4 病原菌藥敏特性的測(cè)定 參照KB紙片擴(kuò)散法[4]進(jìn)行,并根據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):第19版信息增刊》,判定病原菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。其中,藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

      2 結(jié)果

      2.1 病原菌的分離

      結(jié)果見(jiàn)表1。從自然發(fā)病的中華絨螯蟹的肝胰腺中分離純化到5株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌,經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn),證實(shí)菌株DD5對(duì)中華絨螯蟹有致病作用,人工感染中華絨螯蟹的發(fā)病與死亡癥狀與自然病癥基本相同,而且從人工感染的中華絨螯蟹的肝胰腺內(nèi)又可分離到與原菌株形態(tài)特征、理化性質(zhì)一致的菌株,表明菌株DD5是引起該病的病原菌。

      2.2 病原菌的鑒定

      結(jié)果見(jiàn)表2。API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株DD5的生化鑒定結(jié)果表明,菌株DD5為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonaspunctata),鑒定結(jié)果的可信度為99.9%。此外,通過(guò)對(duì)菌株DD5的16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了1400bp大小的片段,其在Gen-Bank上的登錄號(hào)為:KP260655。通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的BLASTN軟件對(duì)菌株DD5的16SrDNA序列與基因庫(kù)中已知菌株的16SrDNA序列進(jìn)行了同源性比較。結(jié)果表明,菌株DD5的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中氣單胞菌屬菌株的16SrDNA序列有99%~100%的同源性。通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株DD5 16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)進(jìn)一步可以看出,菌株DD5與點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌136c株(GenBank登錄號(hào):EU488688)的親緣關(guān)系最近。結(jié)合傳統(tǒng)的生理生化鑒定及16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果,判定菌株DD5為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌。

      表1 分離菌株對(duì)中華絨螯蟹人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of artificial infection test of bacterial isolates Eriocheir sinensis

      表2 菌株DD5的生化特征性鑒定Table 2 Identification of biochemical characteristics of strain DD5

      2.3 病原菌的藥敏特性

      結(jié)果見(jiàn)表3。菌株DD5對(duì)12種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)結(jié)果表明,菌株DD5對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、左氟沙星、復(fù)方新諾明等8種抗生素高度敏感,對(duì)多黏菌素中度敏感,對(duì)氨芐西林、麥迪霉素、萬(wàn)古霉素等3種抗生素耐藥。

      圖1 通過(guò)鄰接法構(gòu)建的基于菌株DD5及相關(guān)菌株16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree based on 16SrDNA sequences of strain DD5and other related strains by neighbor-joining method

      表3 菌株DD5的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of strain DD5

      3 討論

      點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖重要病原菌之一[5],對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具有極強(qiáng)的致病能力[6],可引起中華鱉(Trionyxsinensis)、鯽魚(yú)(Carassiusauratus)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidllus)、縊 蟶(Sinvnovaculaconstricta)等海水、淡水養(yǎng)殖動(dòng)物出現(xiàn)大量死亡,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而,從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料來(lái)看,未見(jiàn)到點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌引起中華絨螯蟹腸炎的研究報(bào)道。本試驗(yàn)證實(shí)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌對(duì)中華絨螯蟹具有致病性,并分析了其生理生化特性與藥敏特性,再一次表明了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的廣泛危害性,也進(jìn)一步豐富了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌的病原學(xué)研究資料。

      腸炎是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見(jiàn)的細(xì)菌性病害之一,病死率一般為30%~60%,嚴(yán)重的可達(dá)95%以上,給養(yǎng)殖戶帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[7]。本試驗(yàn)證實(shí)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌是中華絨螯蟹腸炎的病原菌,能夠?qū)е轮腥A絨螯蟹出現(xiàn)大量死亡。點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌引起中華絨螯蟹腸炎的發(fā)病機(jī)理,可能是由于點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌在腸道內(nèi)大量生長(zhǎng)增殖后侵入腸壁血管,通過(guò)血液循環(huán)遍布至肝胰腺,同時(shí)產(chǎn)生毒力因子,導(dǎo)致肝胰腺和腸道出現(xiàn)病變,引起中華絨螯蟹死亡。當(dāng)然,除了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌本身因素外,該病的發(fā)生可能與養(yǎng)殖戶投喂變質(zhì)飼料或不正常投飼也有較大的關(guān)系。

      生理生化鑒定是細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù)之一[8-9]。然而,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株DD5對(duì)鳥(niǎo)氨酸、肌醇等指標(biāo)的生理生化反應(yīng)與溫海深等[10]報(bào)道的鯽源分離株不同,對(duì)檸檬酸鹽、肌醇等指標(biāo)的生理生化反應(yīng)與李軍等[11]報(bào)道的草魚(yú)源分離株不同。這可能與來(lái)源于不同地區(qū)、養(yǎng)殖動(dòng)物的點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌菌株在地區(qū)、氣候、水質(zhì)條件及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等方面存在差異有關(guān)。因此,為了準(zhǔn)確鑒定菌株DD5,本試驗(yàn)進(jìn)一步采用了16SrDNA序列分析對(duì)菌株DD5的分類地位進(jìn)行分析,以彌補(bǔ)生理生化鑒定的不足,最終證實(shí)了菌株DD5的16SrDNA序列分析結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致,確定菌株DD5為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌。

      水生環(huán)境殘留的抗生素對(duì)細(xì)菌耐藥性的誘導(dǎo)產(chǎn)生、耐藥基因水平擴(kuò)散和垂直傳播具有重要的作用,造成養(yǎng)殖水環(huán)境及動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的增強(qiáng)、養(yǎng)殖動(dòng)物抗病能力降低、抗菌藥物在體內(nèi)積聚而殘留量增大等不良影響,進(jìn)而通過(guò)食物鏈傳遞到人體內(nèi),對(duì)消費(fèi)者身體健康產(chǎn)生了潛在威脅[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌菌株DD5對(duì)鏈霉素、慶大霉素、恩諾沙星等多種水產(chǎn)常用抗菌藥物均未產(chǎn)生耐藥性,說(shuō)明養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中沒(méi)有濫用抗菌藥物,驗(yàn)證了現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中養(yǎng)殖戶反映沒(méi)有濫用抗菌藥物的說(shuō)法,這也為該病的合理用藥防控提供了科學(xué)依據(jù)。除該病的藥物防治外,國(guó)外學(xué)者[13]也針對(duì)生物防治進(jìn)行了點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌噬菌體的分離,為該病生物控制技術(shù)的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

      [1]王成輝.中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)成效顯著[J].上海農(nóng)村經(jīng)濟(jì),2013(12):28-30.

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