青霉素在海帶配子體培養(yǎng)中的作用初探

賽珊 趙楠 武瑞娜 李霞

摘 要 海帶配子體克隆技術的建立具有極其重要的應用價值。配子體克隆及其雜交為通過雜交方法培育優(yōu)良品種和雜交海帶提供了可能。為此，配子體克隆演變?yōu)楹ХN質資源保存和利用的主要手段。

關鍵詞 青霉素；海帶；配子體培養(yǎng)

中圖分類號：S968.421 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）12-128-02

海帶屬（Laminaria）褐藻具有異型世代交替生活史，包括二倍性孢子體世代和單倍性配子體世代。20世紀70年代末，我國遺傳學家方宗熙等發(fā)現(xiàn)在人工培養(yǎng)條件下，雌、雄配子體都能形成無性繁殖系（克?。?，并能產(chǎn)生配子[1]。在海帶育種、育苗、生理及遺傳學研究中發(fā)揮越來越重要的作用[2-3]。目前，海帶種質保存技術主要以保存配子體為主，方法主要是通過人工擦洗抱子囊去除附著的污物和其他生物，然后在煮沸過的海水中放散得到配子體。而這種方法得到的海帶配子體在保存過程中，仍會存有許多細菌并大量繁殖，附著在配子體克隆體表，阻礙了配子體的正常生長，對海帶配子體的生長產(chǎn)生抑制，除此之外，日常管理中的一些操作，也會帶進污染物，導致配子體克隆停止生長、色素變淡，但具體機理不明，推測是生長競爭性的抑制。

為此，嘗試利用青霉素來抑制細菌。青霉素是人類歷史上發(fā)現(xiàn)的第一種抗生素，且應用非常廣泛。青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱，它們具有相似的作用機理。細菌一般都處于低滲（即外界的滲透壓低于細菌體內(nèi)部）的環(huán)境中，因而會自發(fā)地吸收外界的水分。為了防止細胞因吸水過多而膨脹炸裂，細菌在其細胞壁中合成一種名為肽聚糖的物質，以此抵抗細菌體的自發(fā)吸水膨脹。青霉素即作用于肽聚糖的合成過程中，阻止它的合成，進而導致細菌體失去抵抗?jié)B透壓的能力而脹破[4]。

1 材料

選取的實驗材料為901雜交海帶的雌性配子體克隆，它是一個比較有代表性的材料，抗逆性比較強[5]。具體選擇青霉素G鈉作為該實驗用抗生素。

2 方法

2.1 實驗相關的消毒的方法

種質保存的條件之一就是相對的無污染，且要排除物品上污染的干擾，故實驗所用材料和物品初始需要相應的消毒或滅菌。

2.1.1 實驗材料的消毒

實驗用的901雜交海帶的雌性配子體是使用無菌培養(yǎng)技術得來[6]。

2.1.2 實驗物品的消毒

實驗所用的物品經(jīng)過120 ℃，20 min蒸汽高壓滅菌后，再經(jīng)過烘箱120 ℃，2 h高溫處理。

2.1.3 培養(yǎng)液的消毒

所用海水經(jīng)過沉淀，沙濾后，經(jīng)過活性炭吸附，再由5 μm和1 μm規(guī)格pp棉過濾，得到最終的海水。添加N（10 g/L）、P（1 g/L），青霉素G鈉（12 mg/mL）配制成培養(yǎng)液，N、P的母液均是經(jīng)過120 ℃，20 min蒸汽高壓滅菌處理。

2.1.4 培養(yǎng)液的抽濾

加有青霉素G鈉的培養(yǎng)液需要通過膜濾器抽濾的方法處理。采用的濾膜為孔徑是0.22 μm醋酸纖維酯微孔濾膜，孔徑有效地達到了除菌的目的，其不帶電荷的特性又可最大程度地保留培養(yǎng)液中的有效成分。

2.2 實驗方法

為了擁有一個良好的初始狀態(tài)，先用超聲波粉碎儀將一定量的901雜交海帶的雄性配子體克隆簇打碎成較短的細胞段[7]，多次更換培養(yǎng)液后，再經(jīng)過7 d的自然光生長恢復。

設置3組實驗，第1組始終使用加有青霉素G鈉的培養(yǎng)液，第二組中期停加青霉素，改用普通培養(yǎng)液，而最后一組始終使用普通的未加青霉素G鈉的培養(yǎng)液，實驗在在10 ℃，光照強度1500Lx培養(yǎng)。

在傳統(tǒng)海帶配子體克隆種質資源保存過程中，會定期更換培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液的周期一般為30 d。整個實驗期間的操作，包括更換培養(yǎng)液和觀察都在超凈工作臺內(nèi)完成，瓶口等都在酒精燈下過火，確保實驗不被干擾。為了能及時有效地掌握信息，7 d觀察一次。

3 結果和討論

3.1 結果

經(jīng)過120 d的培養(yǎng)后，我們發(fā)現(xiàn)，始終使用加有青霉素G鈉組是最好的一組，整個過程中都不見其它污染物，但顯微鏡下觀察，偶見有孢子體的出現(xiàn)。始終未加入青霉素G鈉組，在后期出現(xiàn)了少量的桿菌和球菌。對此，改用加有青霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)一段時間后，桿菌和球菌明顯減少，但是出現(xiàn)了一種有絲真菌?？梢?，利用青霉素來培養(yǎng)海帶配子體是可行的，而且對已有的污染物能夠很好的控制。

3.2 討論

第一，青霉素G鈉水溶液極不穩(wěn)定，青霉素G鈉鹽易水解，在不同溫度下有效期有很大差異，它隨著溫度的升高，水解加速。所以配制好的青霉素G鈉培養(yǎng)液要及時地使用[8]；第二，為了能有效地控制細菌，每隔一段時間都要使用帶有青霉素G鈉的培養(yǎng)液更換；第三，雖然海帶配子體和細菌的細胞壁組成不同，所以青霉素不會影響海帶配子體細胞壁合成，但是長時間接觸青霉素，對海帶配子體細胞的其它細胞器有無影響，尤其是核心的遺傳物質，特別是第一組出現(xiàn)了孢子體，還有待討論；第四，培養(yǎng)后期出現(xiàn)了其它的污染物，青霉素無法控制，以后可以試驗加入其它藥物聯(lián)合處理。

參考文獻

[1]方宗熙，歐毓麟，崔競進，等.海帶配子體無性繁殖系培育成功[J].科學通報，1978（2）：115-116.

[2]張全勝，羅世菊.海帶種質保存技術的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景[J].水產(chǎn)科技情報，2006，3（2）：61-63.

[3]楊官品，李曉捷，叢義周，等.海帶配子體無性繁殖（克?。┘夹g研究與應用進展[J].中國海洋大學學報，2007，37（4）：569-572.

[4]王磊，任東明.青霉素——從發(fā)現(xiàn)到應用[J].生物學通報，2006（12）：61-62.

[5]李曉捷，王國文，張全勝，等.溫度對“901”海帶配子體克隆生長的影響[J].水產(chǎn)科技情報，2004，31（4）：166-168.

[6]張壯志，錢瑞，羅世菊，等.海帶種質保存防污染技術[J].河北漁業(yè)，2010（5）：30-31.

[7]劉濤，朱明壯，包振民，等.超聲波對海帶配子體克隆的作用[J].海洋湖沼通報，2000（4）：39-44.

[8]郭忠信.不同室溫下的青霉素水溶液失效探討[J].云南醫(yī)藥，1995（4）：298-299.·

（責任編輯：趙中正）