凍融卵裂期胚胎移植中過夜培養(yǎng)對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響

李 榮，許常龍，譚秀群，鄧志華，李春苑，丘 映

(南寧市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)療中心，廣西 南寧 530031)

凍融卵裂期胚胎移植中過夜培養(yǎng)對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響

李 榮，許常龍，譚秀群，鄧志華，李春苑，丘 映

(南寧市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)療中心，廣西 南寧 530031)

目的 探討凍融卵裂期胚胎移植中過夜培養(yǎng)對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響。方法 2011年12月至2012年12月在我院生殖醫(yī)療中心接受玻璃化冷凍的卵裂期胚胎移植患者共237個(gè)周期，其中胚胎解凍時(shí)間為移植當(dāng)日128個(gè)周期(A組)，過夜培養(yǎng)109個(gè)周期(B組)，比較兩組的胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率。結(jié)果 A組胚胎種植率低于B組(P< 0.05)，而臨床妊娠率和流產(chǎn)率與B組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 將胚胎提前解凍培養(yǎng)過夜，觀察解凍后胚胎的進(jìn)一步發(fā)育情況，可提高胚胎種植率，為臨床選擇移植胚胎提供有意義的參考。

凍融胚胎移植；玻璃化冷凍；過夜培養(yǎng)；胚胎種植率；臨床妊娠率

目前凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)已成為輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)技術(shù)中不可缺少的一部分。但是，胚胎細(xì)胞在程序冷凍法冷凍過程中容易形成冰晶，損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞造成致命的傷害，而玻璃化冷凍可以很好地解決這一問題[1]。影響玻璃化凍融胚胎移植的因素很多，本研究通過提前解凍胚胎培養(yǎng)過夜，觀察胚胎進(jìn)一步發(fā)育情況，探討胚胎過夜培養(yǎng)對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響，為臨床提高FET妊娠率提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年12月至2012年12月在我中心接受凍融卵裂期胚胎移植的患者237個(gè)周期?；颊吣挲g20～47歲[(32.11±4.55)歲]；常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF)周期155例，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)周期82例。均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：不孕因素為輸卵管阻塞和(或) 男性少弱精；均為首次 IVF 或 ICSI 治療未育且移植玻璃化冷凍第3天卵裂期胚胎的周期。排除：程序化冷凍胚胎移植周期、囊胚移植周期、解凍后繼續(xù)培養(yǎng)成囊胚再移植周期。其中移植當(dāng)日解凍胚胎128個(gè)周期(A組)，過夜培養(yǎng)109個(gè)周期(B組)。A組年齡(32.22±4.77)歲，平均解凍胚胎數(shù)(2.33±0.59)個(gè)，B組年齡(32.11±4.55)歲，平均解凍胚胎數(shù)(2.20±0.50)個(gè)，兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1 超促排卵 兩組取卵周期超排卵方案均采用我中心常規(guī)長(zhǎng)方案：在前次月經(jīng)周期的第18～20天(黃體中期)使用促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa，達(dá)菲林)降調(diào)節(jié)，注射劑量0.8～1.3 mg，14～16天后復(fù)診，在達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后開始使用促性腺激素(Gn)，結(jié)合陰式超聲及血清黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕激素(P)水平測(cè)定，確定人絨毛膜促性腺激素(hCG)日。當(dāng)主導(dǎo)卵泡中1個(gè)直徑達(dá)18 mm或2個(gè)達(dá)17 mm或3個(gè)達(dá)16 mm時(shí)，可于當(dāng)天停用Gn，并在當(dāng)日22點(diǎn)注射hCG 5000～10000 IU，35～37 h后行陰道B超指引下經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。取卵后根據(jù)患者丈夫精液情況采用IVF或ICSI，胚胎培養(yǎng)，取卵后3天移植胚胎，并將剩余的優(yōu)質(zhì)胚胎予以玻璃化冷凍、保存。FET建議至少于取卵術(shù)后三個(gè)月進(jìn)行。

1.2.2 凍融胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備 ①自然排卵周期：適用于月經(jīng)規(guī)律，無排卵障礙者，于月經(jīng)第10～12天開始經(jīng)陰道超聲監(jiān)測(cè)到優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育至15 mm時(shí)，于血清LH峰后3天或排卵后2天行冷凍胚胎移植。②激素替代周期：應(yīng)用于月經(jīng)周期紊亂及多囊卵巢綜合征及子宮內(nèi)膜異位癥或其它原因?qū)е屡怕颜系K者：月經(jīng)第3～5天口服戊酸雌二醇，根據(jù)患者內(nèi)膜情況，選擇不同起始劑量(4～8 mg/d)，服用5～7天后予以B超，以觀察其子宮內(nèi)膜厚度。超聲監(jiān)測(cè)須至子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm，測(cè)定E2水平，當(dāng)E2> 200 pmol/L時(shí)肌內(nèi)注射黃體酮60 mg/d，同時(shí)繼續(xù)口服戊酸雌二醇。用黃體酮第4天行冷凍胚胎移植。胚胎移植后根據(jù)不同子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及患者個(gè)體情況應(yīng)用不同劑型劑量的孕酮進(jìn)行黃體支持。

1.2.3 胚胎冷凍與解凍 ①試劑與耗材的準(zhǔn)備：玻璃化冷凍試劑盒(Vitrification Kit)；玻璃化解凍試劑盒(Thawing Kit)；玻璃化冷凍載體(JY straw)；剝卵針(Denuding Pipettes)D160和D190。加拿大捷鷹公司(JIEYING Laboratory Inc.)；冷凍皿：Falcon3001；⑥解凍皿：Embryo GPS-010；⑦胚胎培養(yǎng)液：Votrolife 10131。②冷凍操作過程：制備冷凍皿，室溫下平衡20min后，將選擇用于凍存的胚胎1—2枚胚胎置于冷凍液JY-Vl中5 min，再轉(zhuǎn)入冷凍液JY-V2中1min立即將胚胎置于載體上，套上外套管，迅速將載體完全浸入液氮中，靜置10秒左右即可液氮罐貯存。③復(fù)蘇操作過程：制備解凍皿，室溫下平衡20min后，將凍胚載體從液氮取出，迅速置于解凍液JY-T1中3 min，再轉(zhuǎn)入稀釋液JY-T2中3 min，后轉(zhuǎn)入稀釋液JY-T3中3 min，后轉(zhuǎn)入沖洗液JY-T4中3 min，胚胎移入JY-T4后立即將恒溫板溫度升至37 ℃，最后轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)液中，37 ℃ 6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 胚胎解凍時(shí)間 ①A組：移植當(dāng)日上午解凍胚胎，選擇復(fù)活卵裂球≥50%的胚胎進(jìn)行移植。將解凍后存活的1～3個(gè)胚胎培養(yǎng)2 h后移植。②B組：移植前一天下午解凍胚胎，觀察胚胎如有50%以上卵裂球受損，則解凍其他保存的胚胎，培養(yǎng)過夜。移植時(shí)應(yīng)觀察復(fù)蘇后胚胎生長(zhǎng)情況，<50% 卵裂球受損，或至少有一個(gè)卵裂球發(fā)生卵裂，方可用于移植。

1.4 胚胎解凍后觀察指標(biāo)及妊娠確定 優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為獲卵后第1 日(Day1)觀察正常受精、第3日(Day3)評(píng)分為Ⅰ、Ⅱ級(jí)，卵裂球6～12個(gè)的胚胎。以解凍后胚胎存活的卵裂球數(shù)≥50%總細(xì)胞數(shù)作為胚胎復(fù)蘇存活的標(biāo)準(zhǔn)。凍融胚胎移植后14天測(cè)血HCG判斷是否生化妊娠，在移植后4～5周經(jīng)B超確定臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用四格表χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

237個(gè)凍融胚胎周期，解凍胚胎538枚，共移植凍融胚胎509枚，平均每周期移植(2.15±0.53)枚胚胎，其中124枚胚胎著床(凍融胚胎種植率為24.36%)，98例臨床妊娠(臨床妊娠率為41.35%)，13例流產(chǎn)(流產(chǎn)率為13.27%)，4例宮外孕(宮外孕發(fā)生率為1.68%)，81例分娩。A組胚胎種植率低于B組，而臨床妊娠率和流產(chǎn)率與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 兩組胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較 [%(n)]

3 討論

胚胎質(zhì)量和胚胎與子宮內(nèi)膜間是否能夠相互適應(yīng)是胚胎著床成功與否的關(guān)鍵之處[2]。相關(guān)研究表明，早期卵裂胚胎來自胞漿和核同步性較好，并且較為成熟的卵子，具有較好的代謝儲(chǔ)備性能，其IVF-ET成功率也較高。但是，冷凍和復(fù)蘇可導(dǎo)致卵裂球部分或全部裂解甚至凋亡，從而影響胚胎發(fā)育潛能。ALIKANI研究發(fā)現(xiàn)顯微操作損傷鼠胚中的部分卵裂球后，囊胚孵出率顯著降低[3]。因此，去除壞死的卵裂球，則可有效提高凍融移植周期的臨床妊娠率[4]。目前，移植胚胎的選擇標(biāo)準(zhǔn)多是根據(jù)解凍后2～3 h 的胚胎形態(tài)來決定，但隨著商品化序貫培養(yǎng)試劑、培養(yǎng)條件及培育技術(shù)的不斷完善與改進(jìn)，根據(jù)凍融胚胎的繼續(xù)發(fā)育狀況與潛能將成為以后移植胚胎選擇的新標(biāo)準(zhǔn)。陸湘等[5]發(fā)現(xiàn)，通過過夜培養(yǎng)，可使復(fù)蘇后部分破損卵裂球繼續(xù)生長(zhǎng)、卵裂，恢復(fù)正常種植潛能。龔紹瓊等[6，7]認(rèn)為提前解凍培養(yǎng)、選擇進(jìn)一步卵裂的胚胎進(jìn)行移植，有助于提高FET周期臨床妊娠率，改善妊娠結(jié)局。但羅金等[8]則發(fā)現(xiàn)提前一天解凍和當(dāng)天解凍，對(duì)臨床妊娠率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究根據(jù)胚胎解凍時(shí)間分為移植當(dāng)日解凍組和過夜培養(yǎng)組，結(jié)果顯示過夜培養(yǎng)組胚胎種植率高于移植當(dāng)日解凍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。兩組臨床妊娠率、流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。與柴三明等[7]研究結(jié)果相似。提示在臨床中，可通過提前解凍胚胎過夜培養(yǎng)，觀察胚胎復(fù)蘇后進(jìn)一步發(fā)育情況，評(píng)估其發(fā)育潛能，選擇優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植。

[1] 耿潔，胡玉琴，劉蘭蘭.卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植取精失敗周期中的應(yīng)用[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2014，11(1)：156-157.

[2] 王靜，李豫峰，凍融胚胎移植結(jié)局的影響因素研究進(jìn)展[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2009，17(2)：6-8，110.

[3] Alikani M，Olivennes F，Cohen J.Microsurgieal correction of partially degenerate mouse embryos promotes hatching and restores their viability[J].Hum Reprod，1993，8(10)：1723-1728.

[4] Rienzi L，Ubaldi F，Iacobelli M，et al.Developmental potential of fully intact and partially damaged cryopreserved embryos after laser-assisted removal of necrotic blastomeres and post-thaw culture selection[J].Fertil Steril，2005，84(4)：888-894.

[5] 陸湘，李路，高曉紅，等.卵裂球的完整性和生長(zhǎng)與否對(duì)凍融胚胎移植妊娠結(jié)局的影響[J].生殖與避孕，2007，27(8)：518-521.

[6] 龔紹瓊.移植復(fù)蘇后進(jìn)一步卵裂胚胎可提高凍融胚胎移植臨床妊娠率[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2012，12(7).11-13.

[7] 柴三明，王琰，倪亞莉.過夜培養(yǎng)對(duì)凍融胚胎移植周期妊娠結(jié)局的影響[J].生殖與避孕，2010，30(7).490-493.

[8] 羅金，楊菁，徐望明.胚胎凍融后體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響[J].生殖與避孕，2011，31(2)：97-100.

Impact of culture overnight during frozen-thawed cleavage-stage embryo transfers on pregnancy outcome

LI Rong，XUE Chang-long，TAN Xiu-qun，DENG Zhi-hua，LI Chun-yuan，QIU Ying

(Reproductive Medical Center，Nanning Second People’s Hospital，Nanning 530031，China)

QIUYing

Objective To explore the impact of culture overnight during frozen-thawed cleavage-stage embryo transfers on pregnancy outcome.Methods Data of 237 cycles of vitrified cleavage-stage embryos from the Third Affiliated Hospital between December 2011 and December 2012 was retrospectively analyzed.The embryo were divided into group A (embryo was thawed on the day of transplantation) and group B (embryo was culture overnight).The embryo implantation rate，clinical pregnancy rate and abortion rate were compared between the two groups.Results The embryo implantation rate was significantly lower in the group A when compared with that in the group B (P< 0.05).However，no significant difference in clinical pregnancy rate and abortion rate was found between the two groups.Conclusion It may provide a valuable reference for the selection of high quality of embryo when embryos are thawed in advance and cultured overnight，and then the development of embryos can be observed.This method also facilitates the arrangement of laboratory working.

Frozen embryo transplantation；Vitrification；Culture overnight；Embryo implantation rate；Clinical pregnancy rate

廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：GXMUYSF201307)

丘 映

R714；S821.3+6

A

1672-6170(2015)04-0055-03

2014-12-23；

2015-03-24)