HPLC-DAD法檢測染紅中藥材中20種非法添加色素*

李啟艷，朱日然，孫萍，姜國萍

(1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，濟南 250011；3.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

HPLC-DAD法檢測染紅中藥材中20種非法添加色素*

李啟艷1，3，朱日然2，孫萍2，姜國萍1

(1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，濟南 250011；3.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

目的 建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)法同時測定常見染紅中藥材中非法添加的20種人工合成色素。方法 采用70%甲醇超聲提取樣品，通過Agilent TC-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)分離，以甲醇-0.02 mol·L-1醋酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫，于210～650 nm波長范圍用DAD檢測，用保留時間結合待測物的紫外吸收光譜驗證。結果 同時分離并檢測出20種常用紅色及橙色系色素，市售西紅花、朱砂中檢出酸性橙Ⅱ及808猩紅。結論 該方法可同時檢測常見染紅中藥材中常用的非法添加人工合成色素，樣品處理簡便，方法快速，結果準確可靠，重復性好。

中藥材，染色；檢測器，高效液相色譜-二極管陣列；色素檢測；色素，人工合成；朱砂；酸性橙Ⅱ

目前，中藥特別是中藥飲片的非法染色摻假的現(xiàn)象較多，其中色澤鮮艷、價格昂貴、臨床使用頻繁的紅色系藥材如西紅花、朱砂、血竭、丹參等的染色品種更是屢見不鮮[1]，染色藥材不僅貽誤病情，甚至還有毒性[2]，會對人體造成不同程度的危害。若染色藥材經(jīng)進一步加工炮制，其中的化工染料受熱分解產(chǎn)生新的有害物質，對人體危害可能更大[3]。高效液相色譜可以連接不同檢測器并進行定量分析，靈敏度高，分離效果好，是目前色素檢測中使用最廣、研究最多的方法，也是國內檢測色素添加劑的標準方法[4]。因此，筆者建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器(high performance liquid chromatography-diode array detection,HPLC-DAD)法同時測定常見的20種紅色和橙色類人工合成色素，其中包含蘇丹紅等偶氮類強致癌色素品種，可以為藥品監(jiān)督管理部門控制中藥質量提供一定的參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器；Milli-Q 超純水機；Mettler Toledo MS 十萬分之一電子天平；KQ-500DE 型數(shù)控超聲儀。

1.2 試劑 對照品：金橙Ⅰ(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20110711)、酸性橙Ⅱ(阿拉丁試劑有限公司，批號：D1205024)、金橙Ⅳ(國藥集團化學試劑有限公司, 批號：F20121210)、金橙G(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20120311)、甲基橙(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20070815)、羅丹明B (阿拉丁試劑有限公司，批號：D120502)、堿性橙2 (德國CNW試劑有限公司, 批號：6A15G020)、堿性橙21(德國CNW試劑有限公司, 批號：1C46K025)、堿性橙22(德國CNW試劑有限公司, 批號：6A16G050)、酸性紅73(TCI試劑有限公司,BTGGK-PG，批號：KC5KA-05)、誘惑紅[國家標準物質中心，GBW(E)100164，1 mg·mL-1，批號：20140116]、赤蘚紅[國家標準物質中心，GBW(E)100164，1 mg·mL-1，批號：20140101]、胭脂紅[國家標準物質中心，GBW(E)100004a，0.5 mL，批號：20131213]、莧菜紅[國家標準物質中心，GBW(E)100002a，0.5 mg·mL-1，批號：20140101]、蘇丹紅Ⅰ(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，SB05-266-2012，1 mg·mL-1，批號：20131205)、蘇丹紅Ⅱ(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，SB05-267-2012，1 mg·mL-1，批號：20131205)、蘇丹紅Ⅲ(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，SB05-268-2012，1 mg·mL-1，批號：20131211)、蘇丹紅Ⅳ(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，SB05-269-2012，1 mg·mL-1，批號：20131130)、新品紅(國家藥品標準物質，批號：111955-201301)、808猩紅(國家藥品標準物質，批號：111940-201201)。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材 朱砂、西紅花、丹參、血竭均為市售。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)； 流動相:A為0.02 mol·L-1醋酸銨溶液，B 為甲醇，梯度洗脫程序： 0～6 min，A：90%～70%；～15 min，A ：70%～55%；～45 min，A ：55%～40%；～60 min，A：40%～10%；～90 min，A:10%。流速:1.0 mL·min-1，柱溫 ：35 ℃，DAD檢測器掃描范圍:210～650 nm，進樣量:10 μL，理論板數(shù)按金橙Ⅱ計應不低于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取金橙Ⅰ、酸性橙Ⅱ、金橙Ⅳ、金橙G、甲基橙、羅丹明B、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22及酸性紅73 對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成含1.173 mg·mL-1金橙Ⅰ 、1.218 mg·mL-1酸性橙Ⅱ、1.161 mg·mL-1金橙Ⅳ、1.015 mg·mL-1金橙G、1.342 mg·mL-1甲基橙、1.005 mg·mL-1羅丹明B、1.390 mg·mL-1堿性橙2、1.056 mg·mL-1堿性橙21、1.165 mg·mL-1堿性橙22及5.36 mg·mL-1酸性紅73的對照品溶液；精密量取上述各溶液1 ml置50 mL量瓶中，再分取誘惑紅、赤蘚紅、胭脂紅、莧菜紅對照品溶液及蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ對照品溶液1 mL置于同一量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定藥材粗粉2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理( 功率250 W，頻率100 kHz) 20 min,放冷至室溫，再稱定質量，用70% 甲醇補足減失的質量，搖勻，用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 專屬性考察 精密量取混合對照品儲備液1 μL,進樣分析，結果見圖1。供試品溶液中各待測成分色譜峰的分離度均>1.5，方法專屬性良好。酸性橙Ⅱ與赤蘚紅保留時間較為接近，但不同波長下兩峰的吸光度具有較大差異，可同時結合紫外吸收光譜進行鑒別。

1.莧菜紅； 2.胭脂紅； 3.金橙G；4.誘惑紅； 5.金橙Ⅰ； 6.甲基橙；7.新品紅；8.金橙Ⅳ；9.堿性橙2； 10.酸性紅73；11.酸性橙Ⅱ； 12.赤蘚紅； 13.堿性橙21； 14.堿性橙22；15.羅丹明B；16.蘇丹紅Ⅰ；17.808猩紅； 18.蘇丹紅Ⅱ；19.蘇丹紅Ⅲ； 20.蘇丹紅Ⅳ

圖1 混合標準品在波長500 nm處的色譜圖

1.amaranth； 2.carmine； 3.orange G； 4.allura red AC；5.orangeⅠ； 6.methyl orange； 7.new fuchsin； 8.orange Ⅳ； 9.basic orange 2；10.acid red 73； 11.orangeⅡ sodium salt； 12.erythrosin B sodium salt；13.basic orange 21； 14.basic orange 22；15.rhodamine B； 16.SudanhongⅠ；17.808 scarlet；18.SudanhongⅡ；19.SudanhongⅢ； 20.SudanhongⅣ

Fig.1 Chromatogram of mixed standard at 500 nm

2.4 各色素對照品的紫外吸收光譜 取“2.2.1”項的各色素對照品溶液，分別進樣，記錄下各色素的紫外吸收光譜，結果20種色素的最大吸收波長各不相同，波長范圍456～548 nm。

2.5 樣品測定 取各批次市售朱砂、西紅花、丹參、血竭藥材按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，每批平行2次，各進樣10 μL，記錄色譜圖，并與圖1進行對比，若發(fā)現(xiàn)與混合標準溶液在相同保留時間下有明顯的色譜峰，再與該保留時間下的色素對應的紫外吸收光譜進行對比，若二者峰型與最大吸收波長均一致則可認定該樣品中含有該色素。結果發(fā)現(xiàn)市售西紅花、朱砂某批次中檢出酸性橙Ⅱ及808猩紅。見圖2。

1.酸性橙Ⅱ；2.808猩紅

圖2 市售西紅花、朱砂某批次中檢出的酸性橙Ⅱ及808猩紅色譜圖

1.orangeⅡ sodium salt；2.808 scarlet

Fig.2 Chromatogram of orange Ⅱ sodium salt and 808 scarlet in one batch ofCrocistigmaandCinnabaris

3 討論

色譜條件中，本實驗考察了幾種常用的C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(Phenomenex Gemini C18、Thermo ODS HYPERRSIL、Agilent TC-C18、Agilent SB-C18、Waters-Symmetry C18)對20種色素的分離效能，發(fā)現(xiàn)在相同的洗脫條件和柱溫下，Agilent TC-C18可使20種色素全部達到基線分離，且峰形良好。同時還比較了甲醇-水、甲醇-0.02 mol·L-1醋酸銨溶液甲醇-磷酸溶液洗脫系統(tǒng)，結果表明以甲醇-0.02 mol·L-1醋酸銨溶液洗脫系統(tǒng)分離效果最好。在測定波長范圍的選擇上，由于各色素的最大吸收波長明顯不同，故盡可能選擇更寬的測定波長范圍，利于采集紫外吸收光譜進行對比分析。

樣品處理過程中，由于檢測的20種人工合成色素均為水溶性或醇溶性色素，且染色劑都染色在飲片的表面[5]，參照《藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批

準文件(西紅花)》中檢查項下的樣品處理方法，并比較了乙醇、甲醇、水3種提取溶媒及其不同比例的溶液，結果表明70%甲醇提取率最高，且色譜圖中峰型最佳。以70%甲醇為提取溶媒，比較了3種不同的提取方法：加熱提取法、微波提取法、超聲提取法，結果超聲提取法操作簡便，提取率略高于前兩種提取方法；采用超聲提取法，分別考察了加入70%甲醇10，20，30 mL的提取效果，結果表明70%甲醇20，30 mL色素提取量無差異，故選擇70%甲醇20 mL進行提?。徊捎贸暦ǎ尤?0%甲醇20 mL，又分別考察了提取10，15，20，25，30，40 min的提取效果，結果表明多數(shù)品種20 min后，延長提取時間，提取量無差異，且容易提取出檢測色素外的其他成分，故選擇20 min。

從檢驗結果來看，紅色系藥材存在著少許染色現(xiàn)象，使用色素品種以色澤鮮紅、價格便宜、易著色的紅色系色素為主，因此建議相關部門增加紅色系藥材中的色素檢驗項目。

本實驗主要以保留時間結合待測物的紫外吸收光譜對藥材中非法添加的色素進行檢驗，但由于色素品種繁多、藥材中其他成分易干擾等原因，未能建立相關的含量測定方法，有待結合檢驗結果的實際意義進一步研究。

[1] 鄒耀華,殷紅妹,郭怡飚，等.HPLC-PDA法檢測西紅花和紅花中十一種非法添加色素[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010, 20 (11) :2724-2725.

[2] 馬長宏,單作剛,齊家煒，等.中藥染色摻假的研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(2):153-154.

[3] 胡浩彬.當前中藥材和中藥飲片三大制假方法分析[J].藥學與臨床研究，2012, 20(3) :261-263.

[4] 陳馳.基于液相色譜-飛行時間質譜建立食品中著色劑篩查方法的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學，2012：4-5.

[5] 鄭娟，鄒耀華.HPLC-PDA法檢測蒲黃和黃連中十種非法添加色素[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2011, 21 (5) :1078-1082.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.023

Simultaneous Determination of 20 Pigments in Illegally Dyed Chinese Herbs by HPLC-DAD

LI Qiyan1,3，ZHU Riran2,SUN Ping2,JIANG Guoping1

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China；2.DepartmentofPharmacy,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China；3.ShandongInstituteforFoodandDrugControl，Jinan250101,China)

Objective To develop a HPLC-DAD method for the simultaneous determination of 20 synthetic pigments in dyed Traditional Chinese Medicine. Methods The samples were extracted with ultrasonic by 70% methanol, separated on a Agilent TC-C18column (4.6 mm×250 mm，5 μm) by gradient elution using a mobile phase made up of methanol and 0.02 mol·L-1ammonium acetate, and detected at 210-650 nm.The retention times and ultraviolet absorption spectrums were used to test and verify. Results The twenty red and orange synthetic pigments were separated and detected.Orange Ⅱ sodium salt and 808 scarlet were detected in some batch ofCrocistigmaandCinnabaris. Conclusion The method is simple, rapid, accurate, repeatable for determining twenty synthetic pigments in dyed Traditional Chinese Medicine.

Chinese herbs, dyed; Detection, high performance liquid chromatography-diode array ; Detection of pigment; Pigment, synthetic;Cinnabaris; Orange Ⅱ sodium salt

2014-07-07

2014-10-20

*山東省中醫(yī)藥科學技術研究項目(2013-084)

李啟艷(1978-)，女，山東煙臺人，副主任藥師，碩士，研究方向：中藥質量標準。電話：(0)15253118118，E-mail:15253118118@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)05-0655-03