金葉敗毒顆粒防治妊娠中期巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染的實驗研究*

李偉，熊錦文，陳娟娟，劉濤，肖娟，劉靜，張艷麗，馮云，曾雪，陳素華

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030；2.武警湖北總隊醫(yī)院婦科，武漢 430061；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510150；4.山東省泰安市中心醫(yī)院生殖遺傳科，泰安 271000)

金葉敗毒顆粒防治妊娠中期巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染的實驗研究*

李偉1，熊錦文2，陳娟娟3，劉濤4，肖娟1，劉靜1，張艷麗1，馮云1，曾雪1，陳素華1

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030；2.武警湖北總隊醫(yī)院婦科，武漢 430061；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510150；4.山東省泰安市中心醫(yī)院生殖遺傳科，泰安 271000)

目的 觀察金葉敗毒顆粒防治妊娠中期豚鼠巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染的效果。方法 選擇無感染史、性成熟期雌雄豚鼠同籠受精，隨機(jī)選擇妊娠中期母豚鼠，分為3組，每組15只，正常對照組無特殊處理，模型對照組腹腔接種病毒，金葉敗毒組接種病毒同時灌胃給予金葉敗毒顆粒(3.09 mL· kg-1)，7 d后觀察各組母豚鼠病毒血癥發(fā)生率，20 d后觀察各組胎盤感染率、胎仔感染率及死胎率。結(jié)果 正常對照組和模型對照組死胎率分別為8.33%，34.55%(P<0.05)。模型對照組和金葉敗毒組親代感染率分別為86.67%，33.33%；胎盤感染率分別為91.67%，61.22%；胎仔感染率分別為90.91%，48.28%；死胎率分別為34.55%，15.52%(均P<0.05)。結(jié)論 金葉敗毒顆?？蓽p少妊娠中期病毒接種引起的母胎感染及胎仔死亡，減少胎盤感染。

金葉敗毒顆粒；巨細(xì)胞病毒；感染，宮內(nèi)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是人類最常見的宮內(nèi)感染病原體，妊娠期感染可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、小頭畸形、出生后感音神經(jīng)性耳聾、智力障礙、眼視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、新生兒黃疸等不良后果[1-2]。HCMV宮內(nèi)感染導(dǎo)致的長時程神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥患兒數(shù)量已經(jīng)超過了Down 綜合征和胎兒酒精綜合征[3]。目前，HCMV疫苗研制尚未成熟，更昔洛韋廣泛應(yīng)用于防治器官移植及人類免疫缺陷病毒感染并發(fā)HCMV感染患者，但其致畸毒性限制了在圍產(chǎn)期的使用[4]。金葉敗毒顆粒(曾用名：抗炎6號、熱毒清)主要成分包括金銀花(君藥)、大青葉(臣藥)、蒲公英、魚腥草等，是華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所經(jīng)過30余年的基礎(chǔ)研究和臨床研究制備而成的一種清熱解毒中藥，動物實驗表明其無生殖毒性，不會致畸[5]。體外實驗亦證實金葉敗毒顆粒尤其是其主要成分金銀花(主要有效成分為綠原酸)具有體外抗HCMV感染的作用[6-7]。筆者采用豚鼠巨細(xì)胞病毒(guinea pig cytomegalovirus，GPCMV)宮內(nèi)感染實驗動物模型，觀察抗病毒藥物金葉敗毒顆粒防治妊娠中期CMV宮內(nèi)感染的效果，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒 豚鼠胚肺成纖維細(xì)胞株(guinea pig embryo lung fibroblast，GPEL) 和豚鼠巨細(xì)胞病毒標(biāo)準(zhǔn)株22122 均購于美國典藏物種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。病毒采用上述細(xì)胞培養(yǎng)傳代并進(jìn)行病毒毒力檢測。

1.2 試劑與儀器 樹脂型基因組DNA提純試劑盒(批號：G5907)，2×Taq PCR Master Mix，瓊脂糖，大鼠灌胃針(均購于武漢天根生化科技有限公司)，PTC-150型PCR擴(kuò)增儀(Biometra公司)，DYCZ-22B型恒壓恒流電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 藥物與給藥方法 金葉敗毒顆粒由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部制劑中心提供(批準(zhǔn)文號：鄂藥制字Z20111174，批號：20111128，20120620，20121211，20130122，20130416)。按人與豚鼠體質(zhì)量劑量折算系數(shù)[5]，換算每只豚鼠每日給藥劑量(3.09 mL· kg-1)。將每日給藥量均分為3份，每日分3次灌胃給藥。用藥期間，逐日測量豚鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化情況逐日調(diào)整給藥劑量。

1.4 動物模型建立及實驗分組 清潔級Hartley豚鼠，大于6個月齡，雌性體質(zhì)量(650±50) g，雄性體質(zhì)量(700±50) g，購于湖北省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0005，動物合格證號：4200600247。在華中科技大學(xué)實驗動物中心[使用許可證：SCXK(鄂)2010-0057]半屏障環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nested-polymerase chain reaction，N-PCR) 篩查GPCMV-DNA 陰性的雌雄豚鼠，夜間按4：1比例合籠交配，次日清晨觀察雌豚鼠陰道有無精栓，發(fā)現(xiàn)精栓時確認(rèn)為受孕第0天，受孕第1～20天為早期妊娠，第21～40天為中期妊娠，第41天至分娩為晚期妊娠[8]。選擇孕齡21 d雌豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，每組15只：正常對照組不予特殊處理，模型對照組每只腹腔注射GPCMV病毒懸液1 mL，金葉敗毒組在接種病毒的同時灌胃給予金葉敗毒顆粒，連續(xù)14 d。接種病毒7 d母豚鼠心臟采血檢測GPCMV-DNA，接種病毒20 d乙醚麻醉處死母豚鼠，記錄活胎及死胎數(shù)目，無菌收集親代及子代血液、唾液腺、胸腺、腦、肝臟、肺臟、腎臟等臟器組織，檢測各組織GPCMV-DNA。

1.5 檢測方法及條件

1.5.1 N-PCR病原學(xué)檢測 ①引物設(shè)計：兩對引物序列見參考文獻(xiàn)[9-10]，第1對引物序列5′-AAGCTTGAGGGTTGTTATTC-3′和5′-GCCTCGCCTA-TGCCTTTACC-3′，基因位置分別為2 208～2 227和2 667～2 686，擴(kuò)增片段長度為479 bp；第2對引物序列為5′-TGTTATTCTAGACCCG-3′和5′-AATATCTATT-TCGCTGA-3′，基因位置分別為2 220～2 235和2 416～2 432，位于第1次擴(kuò)增片段內(nèi)側(cè)，擴(kuò)增片段長度231 bp。②擴(kuò)增體系：第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL，包括上、下游引物各1.0 μL(10 μmol·L-1)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水8.5 μL、待檢標(biāo)本2.0 μL。第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系24 μL，包含上、下游引物各1.0 μL(10 μmol·L-1)、2×Taq PCR Master Mix 12.0 μL，雙蒸水10.0 μL及第1次擴(kuò)增產(chǎn)物1.0 μL。③擴(kuò)增條件：第1次擴(kuò)增采用94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性25 s、55 ℃復(fù)性25 s、72 ℃延伸50 s共反應(yīng)36個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增采用94 ℃預(yù)變性2 min，再94 ℃變性35 s、42 ℃復(fù)性35 s、72 ℃延伸50 s共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。④結(jié)果判定：取反應(yīng)終產(chǎn)物5 μL，2%瓊脂糖凝膠、90 V電泳30 min，在紫外燈下觀察，攝相。每次均設(shè)置陰性對照(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ毒株)、空白對照和陽性對照(GPCMV懸液)。

1.5.2 病理學(xué)檢查 切取相同大小臟器組織塊，磷酸鹽緩沖液漂洗，10%甲醛緩沖液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色、鏡檢，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)特點。

1.6 診斷標(biāo)準(zhǔn) 母豚鼠感染：血液或任一臟器組織標(biāo)本GPCMV-DNA陽性。胎盤感染：胎盤GPCMV-DNA陽性。宮內(nèi)(胎仔)感染：臍帶血或胎仔任一臟器組織標(biāo)本GPCMV-DNA陽性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 5.0版軟件包進(jìn)行卡方檢驗及雙側(cè)直接概率法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母豚鼠感染情況 各組母豚鼠感染情況見表1。其中，母豚鼠病毒血癥征象包括被毛逆立、少食多睡、體質(zhì)量下降等。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，金葉敗毒顆粒能減少妊娠中期接種GPCMV導(dǎo)致的母豚鼠感染。

表1 3組母豚鼠感染情況

與正常對照組比較，χ2=22.94，*1P<0.01，χ2=30.00，*2P<0.01；與模型對照組比較，χ2=8.89，*3P<0.01

Compared with normol control group，χ2=22.94，*1P<0.01，χ2=30.00，*2P<0.01；Compared with model control group，χ2=8.89，*3P<0.01

2.2 胎盤感染情況 各組胎盤GPCMV-DNA檢測結(jié)果見表2。感染胎盤光鏡下可見單核細(xì)胞或漿細(xì)胞浸潤，間質(zhì)細(xì)胞增生，未見明顯病毒包涵體。表明金葉敗毒顆粒能有效降低孕中期病毒接種導(dǎo)致的胎盤感染。

表2 3組胎盤感染情況

與正常對照組比較，χ2=79.01，*1P<0.01，χ2=47.32，*2P<0.01；與模型對照組比較，χ2=10.03，*3P<0.01

Compared with normol control group，χ2=79.01，*1P<0.01，χ2=47.32，*2P<0.01；Compared with model control group，χ2=10.03，*3P<0.01

2.3 宮內(nèi)感染情況 各組宮內(nèi)感染情況見表3。結(jié)果表明，金葉敗毒顆粒能夠降低妊娠中期病毒接種引起的宮內(nèi)傳播。

2.4 死胎情況 各組死胎情況見表4。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，感染死亡胎仔存在肺間質(zhì)炎性變、唾液腺導(dǎo)管細(xì)胞腫脹變性、腦細(xì)胞水腫、腎曲小管腫脹和間質(zhì)水腫等病變。上述結(jié)果提示，孕中期母豚鼠接種病毒，可引起宮內(nèi)傳播及胎仔死亡，金葉敗毒顆粒能減少妊娠中期病毒接種導(dǎo)致的宮內(nèi)傳播及胎仔死亡。

3 討論

由于豚鼠具有與人類相似的妊娠特點(妊娠周期較長，可模擬3個妊娠階段，胎盤結(jié)構(gòu)相似，GPCMV可以通過胎盤發(fā)生宮內(nèi)傳播等)，GPCMV宮內(nèi)感染臨床表現(xiàn)與HCMV 宮內(nèi)感染相似[7]，應(yīng)用GPCMV宮內(nèi)感染實驗動物模型研究HCMV宮內(nèi)感染發(fā)病機(jī)制、防治方案等，受到國際同行的廣泛認(rèn)可[11-12]。

表3 3組宮內(nèi)(胎仔)感染情況

與正常對照組比較，χ2=96.50，*1P<0.01，χ2=37.98，*2P<0.01；與模型對照組比較，χ2=24.00，*3P<0.01

Compared with normol control group，χ2=96.50，*1P<0.01，χ2=37.98，*2P<0.01；Compared with model control group，χ2=24.00，*3P<0.01

表4 3組死胎情況

與正常對照組比較，χ2=11.94，*1P<0.01，χ2=48.81，*2P<0.01；與模型對照組比較，χ2=5.48，*3P<0.05

Compared with normol control group，χ2=11.94，*1P<0.01，χ2=48.81，*2P<0.01；Compared with model control group，χ2=5.48，*3P<0.05

中醫(yī)理論認(rèn)為，宮內(nèi)感染乃是熱邪之毒侵襲胞宮，辨證施治可采用清熱解毒之法。金葉敗毒顆粒主要有效成分為金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草，主要功效是清熱解毒，急性毒性實驗、長期毒性實驗、生殖毒性實驗結(jié)果均為陰性[5]。體外實驗及整體動物實驗?zāi)Ｐ妥C實，該藥具有抗CMV作用[5]，可減少孕早期病毒接種引起的母胎感染、胎盤感染及胎仔異常[13]。本研究證實，該藥能降低妊娠中期病毒接種引起的母豚鼠感染率、胎盤感染率、胎仔感染率以及胎仔死亡率。減少親代感染率及胎盤感染率，減輕胎盤感染引起的非特異性炎癥反應(yīng)以及相應(yīng)的胎盤功能損傷，可能是該藥阻斷宮內(nèi)傳播、減少死胎的重要機(jī)制之一。筆者將進(jìn)一步研究不同病毒接種劑量、不同給藥劑量下，該藥對GPCMV宮內(nèi)傳播及子代發(fā)育的影響。

[1] SCHLEISS M R.Cytomegalovirus in the neonate：immune correlates of infection and protection[EB/OL].[2013-03-07].http.www.hindawi.com/journals/jir/2013/501801.

[2] NYHOLM J L，SCHLEISS M R.Prevention of maternal cytomegalovirus infection：current status and future prospects [J].Int J Women’s Health，2010，2(1)：23-35.

[3] CANNONANNON M J，F(xiàn)INN D K.Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic [J].BMC Public Health，2005，5(1)：70-77.

[4] LACKNER A，ACHAM A，ALBORNO T，et al.Effect on hearing of ganciclovir therapy for asymptomatic congenital cytomegalovirus infection：four to 10 year follow up [J].J Laryngol Otol，2009，123(4)：391-396.

[5] 陳素華，熊錦文，邢瑋，等.中藥金葉敗毒防治巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染的動物實驗初探 [J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(4)：248.

[6] 姜宏，聞良珍，凌霞珍，等.中藥熱毒清對人巨細(xì)胞病毒抑制作用的實驗與臨床研究 [J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，1999，13(2)：175-179.

[7] 陳娟娟，方建國，陳素華，等.綠原酸體外抗人巨細(xì)胞病毒的實驗研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28(9)：1138-1141.

[8] 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué) [M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：335.

[9] GRIFFITH B P，HSIUNG G D.Cytomegalovirus infection in the guinea pigs，maternal infection at different stages of gestation [J].J Infect Dis，1980，141(4)：787-793.

[10] BIA F J，GRIFFITH B P，F(xiàn)ONG C K Y，et al.Cytomega-lovirus infection in the guinea pig：experimental models for human disease [J].Rev Infect Dis，1983，5(1)：177-195.

[11] HARRISM C J，BRITT W J，CHAPMAN N M，et al.Red-uced congenital cytomegalovirus infection after maternal iImmunization with a guinea pig CMV glycoprotein before gestational primary CMV infection in the guinea pig model [J].J Infect Dis，1995，172(5)：1212-1220.

[12] OLEJNICZAK M J，CHOI K Y，MCVOY M A，et al.Intra-vaginal cytomegalovirus(CMV) challenge elicits maternal viremia and results in congenital transmission in a guinea pig model [J].Virol J，2011，8(1)：89.

[13] 陳素華，熊錦文，邢瑋，等.金葉敗毒治療孕早期豚鼠巨細(xì)胞病毒感染的研究 [J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2004，23(1)：1-3.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.005

Experimental Study of Prevention and Therapeutic Effect ofJinyebaiduGranules on Cytomegalovirus Infection During Mid-pregnancy

LI Wei1, XIONG Jinwen2, CHEN Juanjuan3, LIU Tao4, XIAO Juan1, LIU Jing1, ZHANG Yanli1, FENG Yun1, ZENG Xue1, CHEN Suhua1

(1.DepartmentofObstericsandGynecology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China; 2.DepartmentofGynecology,HubeiGeneralHospital,ChineseArmedPoliceForce，Wuhan430061,China; 3.DepartmentofObstericsandGynecology,theThirdHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China; 4.CenterforReproductiveGenetics,TaianCentralHospitalofShandongProvince,Taian271000,China)

Objective To study the effect ofJingyebaidugranules on treating cytomegalovirus (CMV) infection during mid-pregnancy. Methods The sexually mature guinea pigs with no CMV infection history served as the subjects.Put the male and female ones in the same cages.Then the female ones were randomly divided into three groups during mid-pregnancy.Model control group: 15 guinea pigs which were inoculated 1 mL suspension of GPCMV intraperitoneally.Jingyebaidugroup: 15 guinea pigs which were treated withJingyebaidu(3.09 mL·kg-1)through stomach perfusion after inoculation for 14 days.Normal control group: 15 normal mid-pregnant guinea pigs.Viremia rates were examined 7 days after infection.All animals were sacrificed 20 days after infection.The placenta infection rate, pup infection rate, still-born rate were examined. Results Compared with the normal controls, the still-born rate was increased in model control group(8.33%vs34.55%,P<0.05).In comparison to the model control group, the GPCMV maternal infection rate(86.67%vs33.33%), placenta infection rate(91.67%vs61.22%), pup infection rate(90.91%vs48.28%), still-born rate(34.55%vs15.52%) were significantly decreased in theJinyebaidugroup (allP<0.05). ConclusionJinyebaidugranules could reduce maternal infection，pup loss, and placenta infection caused by CMV inoculation during mid-pregnancy.

Jingyebaidugranules; Cytomegalovirus; Infection, intrauterine

2014-02-14

2014-07-13

*國家自然科學(xué)基金資助項目(81200354)

李偉(1984 -)，男，河南信陽人，在讀博士，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究。電話：027-83663857，E-mail：topliwei@hotmail.com。

陳素華(1961-)，女，湖北武漢人，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究。電話：027-83663857，E-mail：chen_suhua@mail.hust.edu.cn。

R978.7；R286；R285.5

A

1004-0781(2015)05-0585-04