細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌多樣性及促生能力分析

張 禮， 童文君， 薛慶云， 丁小余

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 210023)

細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌多樣性及促生能力分析

張 禮， 童文君， 薛慶云， 丁小余①

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京 210023)

對(duì)采自湖北省英山縣的細(xì)莖石斛〔Dendrobiummoniliforme(Linn.) Sw.〕根、莖和葉中的內(nèi)生細(xì)菌及其根圍苔蘚內(nèi)生細(xì)菌和根圍土壤細(xì)菌進(jìn)行分離，并采用擴(kuò)增核糖體DNA限制性酶切分析(ARDRA)與UPGMA聚類(lèi)分析相結(jié)合的方法對(duì)這些細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定和多樣性分析；在此基礎(chǔ)上，采用平板檢測(cè)技術(shù)測(cè)定了這些細(xì)菌菌株的解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素和嗜鐵素的能力。結(jié)果顯示：從細(xì)莖石斛根和莖以及根圍苔蘚和根圍土壤中共分離獲得75株細(xì)菌菌株，從葉中未分離出內(nèi)生細(xì)菌。其中，源自根和莖的內(nèi)生細(xì)菌菌株分別為14和7株；源自根圍苔蘚的內(nèi)生細(xì)菌菌株偏少，僅14株；源自根圍土壤的細(xì)菌菌株最多，達(dá)到40株。75株菌株可被分成33個(gè)ARDRA簇，通過(guò)16SrDNA序列測(cè)定及比對(duì)，它們分別隸屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、潘多拉菌屬(Pandoraea)、微桿菌屬(Microbacterium)、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和泛菌屬(Pantoea)，其中芽孢桿菌屬和假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)屬。在75株內(nèi)生和根圍細(xì)菌中，有22株菌株兼具解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的能力、25株菌株具有解鉀能力、64株菌株具有產(chǎn)生長(zhǎng)素能力、39株菌株具有產(chǎn)嗜鐵素能力，其中有9株菌株兼具解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素和嗜鐵素的能力?？傮w上看，細(xì)莖石斛的內(nèi)生和根圍細(xì)菌數(shù)量多且多樣性較高，其中9株兼具4種促生潛力的菌株可作為促進(jìn)細(xì)莖石斛生長(zhǎng)的候選菌株。

細(xì)莖石斛； 內(nèi)生細(xì)菌； 根圍細(xì)菌； ARDRA分析； 多樣性； 促生能力

細(xì)莖石斛〔Dendrobiummoniliforme(Linn.) Sw.〕屬石斛屬 (DendrobiumSw.) 多年生附生草本植物，為傳統(tǒng)名貴中藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、止咳潤(rùn)肺等功效[1]。由于細(xì)莖石斛種子自然萌發(fā)困難，加之人們長(zhǎng)期、無(wú)節(jié)制的采挖，其野生資源日漸枯竭[2]。

石斛屬植物與其內(nèi)生菌間存在復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系[3]，內(nèi)生真菌可為石斛屬植物提供營(yíng)養(yǎng)源，因此，相關(guān)研究者除對(duì)石斛屬植物可培養(yǎng)內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定外[4-5]，還對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌與寄主植物的相關(guān)性進(jìn)行了較多研究。已有研究表明：從杓唇石斛〔D.moschatum(Buch.-Ham.) Sw.〕根部分離出的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)和分枝菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌均能夠明顯提高杓唇石斛的種子萌發(fā)率[6]；俞婕等[7]將鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)組培苗接種其內(nèi)生細(xì)菌ZJSH1 后，組培苗的株高、根粗和葉片大小等均優(yōu)于對(duì)照；分離自雙色石斛(D.chrysopterumSchuit. et de Vogel)葉片的2株芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株可以有效防治由鐮刀菌屬(Fusarium)細(xì)菌引起的雙色石斛葉斑病[8]；童文君等[9]從美花石斛(D.loddigesiiRolfe)體內(nèi)分離出具有解磷、解鉀及產(chǎn)生長(zhǎng)素能力的內(nèi)生細(xì)菌，且部分菌株對(duì)美花石斛試管苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。由此可見(jiàn)，細(xì)菌在石斛屬植物的生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用，因此，開(kāi)展對(duì)石斛屬植物內(nèi)生和根圍細(xì)菌的研究具有十分重要的意義。

然而，目前鮮見(jiàn)關(guān)于細(xì)莖石斛內(nèi)生及根圍細(xì)菌的研究報(bào)道。欲明確細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌對(duì)其生長(zhǎng)的影響，首先要明確其內(nèi)生和根圍細(xì)菌的多樣性。鑒于此，作者對(duì)細(xì)莖石斛的內(nèi)生和根圍細(xì)菌(包括根圍苔蘚內(nèi)生細(xì)菌和根圍土壤細(xì)菌)分別進(jìn)行分離和純化，采用擴(kuò)增核糖體DNA限制性酶切分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)法對(duì)分離的菌株進(jìn)行多樣性分析，并對(duì)所有分離菌株的解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素和嗜鐵素能力進(jìn)行檢測(cè)，以期初步揭示細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的相互關(guān)系及促生潛力，為篩選對(duì)細(xì)莖石斛有益的促生細(xì)菌、提高細(xì)莖石斛的藥材產(chǎn)量和藥用活性成分含量提供研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2012年6月，在湖北省英山縣細(xì)莖石斛種植園內(nèi)隨機(jī)采集3份樣品，分別置于密封袋中保存、備用。每份樣品包括5株細(xì)莖石斛(分成根、莖、葉3部分)及附生的根圍苔蘚和緊附于根系表面的根圍土壤。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離和保存 取細(xì)莖石斛的根、莖和葉及其根圍苔蘚樣品，每份2 g，先后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1% HgCl2對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒[10]；將消毒后的樣品分別放入滅菌研缽中，加入9倍樣品質(zhì)量的滅菌生理鹽水(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液)，充分研碎；取0.1 mL研磨液涂于NA培養(yǎng)基平板[11]上，置于28 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)1～3 d，挑選形態(tài)特征不同的菌落分別進(jìn)行純化。

用軟毛刷輕輕刷下附著于細(xì)莖石斛根系表面的根圍土壤，每份土樣取3 g，分別置于滅菌離心管中，加入27 mL滅菌生理鹽水(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液)，渦旋混勻3～5 min后置于200 r·min-1搖床上室溫振蕩30 min；對(duì)振蕩后的菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?.1 mL 10-4稀釋菌液涂于NA培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)1～3 d，挑選形態(tài)特征不同的菌落分別進(jìn)行純化。

純化的細(xì)菌均分為2份，一份在常溫下用無(wú)菌水保存，另一份在-80 ℃條件下用體積分?jǐn)?shù)40%甘油保存。

1.2.2 ARDRA分析 細(xì)菌基因組DNA提取、細(xì)菌16SrRNA片段擴(kuò)增以及ARDRA分析方法與童文君等[9]的方法一致，擴(kuò)增片段經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后用于ARDRA分析。

利用GelCompar Ⅱ軟件對(duì)ARDRA分析的酶切產(chǎn)物圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。基于Pearson相關(guān)指數(shù)的相似性系數(shù)(Pearson correlation indices of similarity)、采用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法 (unweighted pair-group method using arithmetic average，UPGMA) 繪制聚類(lèi)圖，具體參數(shù)如下：optimization (0.45%)，position tolerance (1.5%)，chance towards end of fingerprint (0%)，minimum height (0%)，minimum surface (0%)，uncertain bands (ignore)。以80.0%相似度為基準(zhǔn)進(jìn)行聚類(lèi)分析；從菌株活化到酶切，對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行重復(fù)，菌株間的相似度均大于80.0%則聚為一簇。

選取各ARDRA簇的代表菌株進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，將所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)；選取同源性高的菌株，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 細(xì)菌的促生潛力分析 將所有分離出的細(xì)菌菌株分別用NA培養(yǎng)基進(jìn)行活化[9]。挑取單菌落到含1 mL NA液體培養(yǎng)基的Eppendorf管中，28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (18～24 h)，備用。

1.2.3.1 解磷能力分析 取10 μL待測(cè)菌液，分別滴到含有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的培養(yǎng)基[12]平板上， 28 ℃恒溫暗培養(yǎng)72 h。觀察2種培養(yǎng)基平板上有無(wú)透明菌圈并測(cè)量透明菌圈的半徑，能夠形成透明菌圈的菌株具有解磷能力，無(wú)透明菌圈的菌株則無(wú)解磷能力。每個(gè)菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.3.2 解鉀能力分析 用以鉀長(zhǎng)石粉為惟一鉀源的硅酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌解鉀能力檢測(cè)[13]。取10 μL待測(cè)菌液，滴到含鉀長(zhǎng)石粉的培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)10 d。觀察平板上有無(wú)透明光滑油滴，有透明油滴狀菌落記為“+”，無(wú)透明油滴狀菌落記為“-”；能夠形成透明油滴狀菌落的菌株具有解鉀能力，反之則無(wú)解鉀能力。每個(gè)菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.3.3 產(chǎn)生長(zhǎng)素能力分析 將待測(cè)細(xì)菌接種到含有200 mg·L-1L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h， 10 000 r·min-1離心10 min；取1 mL上清液，加入2 mL Salkowski比色液[14]，混勻后室溫下避光靜置30 min，觀察溶液顏色變化，溶液呈粉紅色表明該菌株能夠產(chǎn)生長(zhǎng)素。每個(gè)菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

對(duì)具有產(chǎn)生長(zhǎng)素能力的菌株進(jìn)行定量檢測(cè)。首先測(cè)定菌懸液的OD600值，用含有200 mg·L-1L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基將所有菌懸液濃度調(diào)節(jié)一致；28 ℃、10 000 r·min-1離心10 min；取上清液，分別加入上清液2倍體積的Salkowski比色液，混勻后室溫下避光靜置30 min，測(cè)定溶液的OD530值[15-16]，各菌株均重復(fù)檢測(cè)3次。根據(jù)Mishra等[17]的方法繪制各菌株生長(zhǎng)素產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用EXCEL 2007軟件計(jì)算各菌株的生長(zhǎng)素產(chǎn)量。

1.2.3.4 產(chǎn)嗜鐵素能力分析 參照文獻(xiàn)[18]配制能夠檢測(cè)嗜鐵素的WA培養(yǎng)基；取10 μL待測(cè)菌液，滴加到培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)3 d。觀察菌落顏色變化，具橘黃色暈圈說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)嗜鐵素的能力， 并測(cè)量暈圈半徑。每個(gè)菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

2 結(jié)果和分析

2.1 細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的分布特征

依據(jù)菌落形態(tài)的差異，共分離獲得細(xì)莖石斛內(nèi)生細(xì)菌和根圍細(xì)菌75株。其中，源自細(xì)莖石斛植株的內(nèi)生細(xì)菌21株，編號(hào)為DmB1至DmB21，包括源自根中的菌株14株和源自莖中的菌株7株，從葉中沒(méi)有獲得內(nèi)生細(xì)菌；源自根圍苔蘚的內(nèi)生細(xì)菌14株，編號(hào)為DmBM1至DmBM14，數(shù)量偏少；源自根圍土壤的菌株數(shù)量最多，共40株，編號(hào)為DmBR1至DmBR40。

2.2 細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的多樣性分析

對(duì)75株細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的ARDRA分析結(jié)果以及基于ARDRA分析結(jié)果的UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)：75株細(xì)菌菌株共形成37種ARDRA譜型， 根據(jù)80%的相似度劃分，75株細(xì)菌菌株被分為33個(gè)ARDRA簇，多樣性較高。有17個(gè)ARDRA簇只包含1株細(xì)菌菌株，其他16個(gè)ARDRA簇則包含2株及2株以上的細(xì)菌菌株。其中，最大的ARDRA簇 (第31簇) 包含13株細(xì)菌菌株，其中2株分離自細(xì)莖石斛的根，3株分離自細(xì)莖石斛的莖，6株分離自根圍土壤，2株分離自根圍苔蘚。

由圖1還可見(jiàn)：細(xì)莖石斛根部?jī)?nèi)生細(xì)菌分屬于9個(gè)ARDRA簇，莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌分屬于4個(gè)ARDRA簇，根圍土壤細(xì)菌分屬于21個(gè)ARDRA簇，根圍苔蘚內(nèi)生細(xì)菌則分屬于8個(gè)ARDRA簇。

從33個(gè)ARDRA簇中分別隨機(jī)選出1株細(xì)菌，對(duì)其16SrRNA基因片段(長(zhǎng)度約1 500 bp)進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)分別為KF720904至KF720936。應(yīng)用MEGA 5.0軟件對(duì)這些序列及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與其相似性在99%以上的序列進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

DmB: 分離自細(xì)莖石斛的內(nèi)生菌株 Endophytic bacterium strains isolated fromDendrobiummoniliforme; DmBR: 分離自根圍土壤的菌株 Strains isolated from rhizosphere soil; DmBM: 分離自根圍苔蘚的內(nèi)生菌株 Endophytic bacterium strains isolated from rhizosphere moss.

圖1 細(xì)莖石斛75株內(nèi)生和根圍細(xì)菌的ARDRA及聚類(lèi)分析結(jié)果

Fig. 1 Reaults of ARDRA and cluster analyses on 75 strains of endophytic and rhizosphere bacteria ofDendrobiummoniliforme(Linn.) Sw.

分支上的數(shù)值代表1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)的自展支持率 Datums on the branches indicate the bootstrap value of 1 000 replications. 所有具有登錄號(hào)的序列均引自GenBank, 括號(hào)內(nèi)為登錄號(hào) All of sequences with accession Nos. are induced from GenBank, and the accession Nos. are in brackers. DmB: 分離自細(xì)莖石斛的內(nèi)生菌株 Endophytic bacterium strains isolated fromDendrobiummoniliforme; DmBR: 分離自根圍土壤的菌株 Strains isolated from rhizosphere soil; DmBM: 分離自根圍苔蘚的內(nèi)生菌株 Endophytic bacterium strains being isolated from rhizosphere moss.

圖2 基于16SrDNA 序列構(gòu)建的細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌與相似細(xì)菌的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig. 2 NJ phylogenetic tree of endophytic and rhizosphere bacteria ofDendrobiummoniliforme(Linn.) Sw. and

similar bacteria based on 16SrDNA sequence

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)：分離出的細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌隸屬于8個(gè)屬，分別為鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、潘多拉菌屬(Pandoraea)、微桿菌屬(Microbacterium)、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和泛菌屬(Pantoea)。其中，芽孢桿菌屬(29株)和假單胞菌屬(16株)為細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬，并且前者均存在于細(xì)莖石斛根和莖內(nèi)以及根圍苔蘚體內(nèi)和根圍土壤中，后者僅存在于細(xì)莖石斛根內(nèi)和根圍土壤中。此外，微桿菌屬(1株)僅分布于細(xì)莖石斛根中；泛菌屬(2株)僅分布于細(xì)莖石斛莖內(nèi)；拉恩氏菌屬(15株)在細(xì)莖石斛的莖和根內(nèi)以及根圍苔蘚體內(nèi)和根圍土壤中均有分布；鏈霉菌屬(3株)僅分布于細(xì)莖石斛的根圍土壤中；潘多拉菌屬(1株)分布于細(xì)莖石斛莖內(nèi)；賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬(8株)分布于細(xì)莖石斛根內(nèi)以及根圍苔蘚體內(nèi)和根圍土壤中。

2.3 細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的促生能力分析

對(duì)分離自細(xì)莖石斛根和莖的內(nèi)生細(xì)菌以及分離自根圍土壤和根圍苔蘚的細(xì)菌進(jìn)行促生能力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

菌株1)Strain1)來(lái)源Source簇號(hào)ClusterNo．菌圈半徑/cm2)Radiusofbacteriumring2)NPAOPA解鉀能力3)Abilityofsolubilizingpotassium3)生長(zhǎng)素產(chǎn)量/μg·mL-1Productionofauxin暈圈半徑/cm4)Radiusofaureola4)DmBM1苔蘚Moss310．00±0．002．67±0．58-63．02±0．580．00±0．00DmBM2苔蘚Moss290．00±0．003．00±1．00+70．80±3．000．00±0．00DmBM3苔蘚Moss182．33±0．580．00±0．00+84．09±2．785．00±0．00DmBM4苔蘚Moss272．12±0．588．30±1．15+91．78±3．126．33±1．00DmBM5苔蘚Moss150．00±0．000．00±0．00-0．00±0．004．33±0．58DmBM6苔蘚Moss150．00±0．001．67±0．58-70．58±2．357．00±0．00DmBM7苔蘚Moss150．00±0．002．00±1．00-0．00±0．000．00±0．00DmBM8苔蘚Moss90．00±0．001．00±0．00+70．30±3．380．00±0．00DmBM9苔蘚Moss270．00±0．008．67±2．08-0．00±0．000．00±0．00DmBM10苔蘚Moss151．67±0．581．00±0．00+81．38±2．764．33±0．58DmBM11苔蘚Moss150．00±0．000．00±0．00-84．09±4．580．00±0．00DmBM12苔蘚Moss310．00±0．009．00±2．00-0．00±0．000．00±0．00DmBM13苔蘚Moss302．00±0．0010．67±0．58-70．22±1．156．00±0．00DmBM14苔蘚Moss172．00±0．006．00±0．00-49．87±2．364．00±0．00DmBR1土壤Soil310．00±0．000．00±0．00+77．56±4．135．00±0．00DmBR2土壤Soil90．00±0．000．00±0．00-0．00±0．003．00±0．00DmBR3土壤Soil122．00±0．004．67±1．15+49．64±4．016．00±0．00DmBR4土壤Soil132．33±0．587．00±0．00-42．22±3．066．00±0．00DmBR5土壤Soil321．00±0．000．00±0．00-77．91±1．590．00±0．00DmBR6土壤Soil42．00±0．007．00±0．00-105．51±2．642．00±0．00DmBR7土壤Soil210．00±0．000．00±0．00-84．76±3．360．00±0．00DmBR8土壤Soil332．67±1．535．00±0．00+42．53±4．090．00±0．00DmBR9土壤Soil72．00±0．006．00±0．00+77．16±1．954．00±0．00DmBR10土壤Soil73．33±1．536．33±0．58+42．89±3．373．00±0．00DmBR11土壤Soil310．00±0．000．00±0．00-0．00±0．000．00±0．00DmBR12土壤Soil250．00±0．000．00±0．00-112．27±2．012．00±0．00DmBR13土壤Soil112．67±1．154．33±3．79-105．11±3．773．00±0．00DmBR14土壤Soil313．00±1．002．00±3．46+77．56±4．080．00±0．00DmBR15土壤Soil214．00±1．730．33±0．58+105．33±3．464．00±0．00DmBR16土壤Soil66．33±0．582．00±3．46+84．00±3．793．00±0．00DmBR17土壤Soil25．33±0．580．00±0．00-105．33±2．174．00±0．00DmBR18土壤Soil210．00±0．000．00±0．00+119．20±4．192．00±0．00DmBR19土壤Soil313．67±1．530．00±0．00-70．09±2．880．00±0．00DmBR20土壤Soil74．33±3．060．00±0．00+91．38±1．995．00±0．00

續(xù)表1 Table 1 (Continued)

菌株1)Strain1)來(lái)源Source簇號(hào)ClusterNo．菌圈半徑/cm2)Radiusofbacteriumring2)NPAOPA解鉀能力3)Abilityofsolubilizingpotassium3)生長(zhǎng)素產(chǎn)量/μg·mL-1Productionofauxin暈圈半徑/cm4)Radiusofaureola4)DmBR21土壤Soil313．00±1．000．00±0．00+0．00±0．005．00±0．00DmBR22土壤Soil324．67±2．080．00±0．00-56．13±3．922．00±0．00DmBR23土壤Soil13．67±2．080．00±0．00-0．00±0．004．00±0．00DmBR24土壤Soil300．00±0．000．00±0．00+105．73±4．863．00±0．00DmBR25土壤Soil13．67±2．087．67±2．08+105．16±3．555．00±0．00DmBR26土壤Soil74．00±1．7310．00±1．00 -98．76±2．114．00±0．00DmBR27土壤Soil234．00±1．737．67±1．15-98．13±3．154．00±0．00DmBR28土壤Soil103．67±2．8910．33±0．58 +105．47±2．334．00±0．00DmBR29土壤Soil320．00±0．000．00±0．00+112．58±3．473．00±0．00DmBR30土壤Soil310．00±0．000．00±0．00-98．71±2．550．00±0．00DmBR31土壤Soil72．33±0．580．00±0．00+84．71±1．135．66±1．53DmBR32土壤Soil282．00±1．000．00±0．00+126．00±4．390．00±0．00DmBR33土壤Soil82．67±0．580．00±0．00-119．07±3．384．00±0．00DmBR34土壤Soil102．33±0．580．00±0．00-105．64±2．904．00±0．00DmBR35土壤Soil12．00±1．000．00±0．00-77．60±2．984．00±0．00DmBR36土壤Soil32．00±1．000．00±0．00+126．27±1．980．00±0．00DmBR37土壤Soil182．00±0．005．00±2．00-84．58±3．783．00±0．00DmBR38土壤Soil181．33±0．583．33±1．53-63．42±1．550．00±0．00DmBR39土壤Soil180．00±0．007．33±1．15-161．69±2．560．00±0．00DmBR40土壤Soil32．33±0．585．00±2．00-112．40±1．535．00±0．00DmB1根Root310．00±0．002．33±0．58-91．33±2．331．00±0．00DmB2根Root200．00±0．000．00±0．00-0．00±0．000．00±0．00DmB3根Root180．00±0．000．00±0．00-119．24±4．980．00±0．00DmB4根Root140．00±0．000．00±0．00-175．47±3．280．00±0．00DmB5根Root310．00±0．000．00±0．00-77．42±2．030．00±0．00DmB6根Root220．00±0．000．00±0．00-136．00±1．630．00±0．00DmB7根Root220．00±0．000．00±0．00-147．33±2．390．00±0．00DmB8根Root180．00±0．000．00±0．00+77．73±1．830．00±0．00DmB9根Root290．00±0．000．00±0．00-70．22±2．761．33±0．16DmB10根Root190．00±0．000．00±0．00-184．04±1．970．00±0．00DmB11根Root180．00±0．000．00±0．00-175．64±3．810．00±0．00DmB12根Root170．00±0．000．00±0．00-168．58±3．020．00±0．00DmB13根Root160．00±0．000．00±0．00-287．47±2．670．00±0．00DmB14根Root180．00±0．0010．00±0．00 -273．02±3．990．00±0．00DmB15莖Stem260．00±0．007．33±0．58-210．24±1．935．00±0．00DmB16莖Stem50．00±0．001．00±1．00+231．51±3．880．00±0．00DmB17莖Stem263．00±1．008．67±1．15-136．42±2．220．00±0．00DmB18莖Stem313．00±1．000．00±0．00-112．71±3．350．00±0．00DmB19莖Stem310．00±0．000．00±0．00-0．00±0．000．00±0．00DmB20莖Stem243．67±1．530．00±0．00-280．04±3．440．00±0．00DmB21莖Stem311．00±1．730．00±0．00-0．00±0．000．00±0．00

1)DmB: 分離自細(xì)莖石斛的內(nèi)生菌株 Endophytic bacterium strains isolated fromDendrobiummoniliforme; DmBR: 分離自根圍土壤的菌株 Strains isolated from rhizosphere soil; DmBM: 分離自根圍苔蘚的內(nèi)生菌株 Endophytic bacterium strains isolated from rhizosphere moss.

2)用不同培養(yǎng)基上的菌圈半徑表示解磷能力 Ability of solubilizing phosphous is showed by radius of bacterium ring on different media; NPA: 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基 Inorganic phosphorus medium; OPA: 有機(jī)磷培養(yǎng)基 Organic phosphorus medium.

3)+: 具有解鉀能力 With ability of solubilizing potassium; -: 無(wú)解鉀能力 Without ability of solubilizing potassium.

4)用培養(yǎng)基上的暈圈半徑表示產(chǎn)嗜鐵素能力 Ability of producing siderophore are showed by radius of aureola on medium.

2.3.1 解磷能力分析 測(cè)定結(jié)果(表1)顯示：在分離獲得的75株細(xì)菌菌株中，有34株細(xì)菌(包括細(xì)莖石斛內(nèi)生細(xì)菌5株、根圍苔蘚內(nèi)生細(xì)菌11株、根圍土壤細(xì)菌18株)能夠在有機(jī)磷 (OPA) 培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生透明菌圈，菌圈半徑為0.33～10.67 cm，說(shuō)明這些菌株具有分解有機(jī)磷的能力；有39株細(xì)菌(包括細(xì)莖石斛內(nèi)生細(xì)菌4株、根圍苔蘚內(nèi)生細(xì)菌5株、根圍土壤細(xì)菌30株)能夠在無(wú)機(jī)磷 (NPA) 培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生透明菌圈，菌圈半徑為1.00～6.33 cm，說(shuō)明這些菌株具有分解無(wú)機(jī)磷的能力。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在OPA和NPA培養(yǎng)基平板上都能夠產(chǎn)生透明菌圈的菌株共有22株，其中21株分離自根圍土壤和根圍苔蘚，且這22株菌株以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，分別為9和8株。

2.3.2 解鉀能力分析 在分離獲得的75株細(xì)菌菌株中，有25株菌株能夠在以鉀長(zhǎng)石為惟一鉀源的硅酸鹽培養(yǎng)基上形成油滴狀菌落，說(shuō)明這些菌株具有解鉀能力(見(jiàn)表1)。其中，23株菌株分離自根圍苔蘚和根圍土壤，且這25株菌株以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，分別有11和7株。

2.3.3 產(chǎn)生長(zhǎng)素能力分析 在分離獲得的75株細(xì)菌菌株中，有64株菌株能夠產(chǎn)生長(zhǎng)素，生長(zhǎng)素產(chǎn)量為42.22～287.47 μg·mL-1(見(jiàn)表1)。其中，生長(zhǎng)素產(chǎn)量高于100 μg·mL-1的菌株有30株，包括細(xì)莖石斛內(nèi)生細(xì)菌14株和根圍土壤細(xì)菌16株。分離自細(xì)莖石斛根部的芽孢桿菌屬菌株DmB13的產(chǎn)生長(zhǎng)素能力最強(qiáng)，生長(zhǎng)素產(chǎn)量達(dá)到287.47 μg·mL-1。

2.3.4 產(chǎn)嗜鐵素能力分析 在分離獲得的75株細(xì)菌菌株中，有39株菌株能夠在WA培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生橘黃色暈圈，暈圈半徑為1.00～7.00 cm(見(jiàn)表1)。其中，36株菌株分離自根圍苔蘚和根圍土壤，且這39株菌株以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，各為14株；產(chǎn)嗜鐵素能力最強(qiáng)的菌株為分離自根圍苔蘚內(nèi)的芽孢桿菌屬菌株DmBM13。

2.3.5 促生能力綜合分析 綜合分析結(jié)果表明：在分離獲得的75株細(xì)菌菌株中，有9株細(xì)菌兼具解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素和嗜鐵素的能力，包括假單胞菌屬菌株4株、芽孢桿菌屬菌株3株、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬菌株1株和鏈霉菌屬菌株1株，這些菌株主要分離自細(xì)莖石斛的根圍土壤(7株)和根圍苔蘚(2株)。

3 討論和結(jié)論

ARDRA法是通過(guò)采用合適的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)細(xì)菌的核糖體DNA片段進(jìn)行酶切分析以研究細(xì)菌多樣性并在屬甚至種水平對(duì)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定的研究方法[19]，可單獨(dú)或與其他分子標(biāo)記聯(lián)合用于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分類(lèi)學(xué)研究[20-21]。將ARDRA用于分析細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌的多樣性較16SrDNA序列測(cè)序更方便、快捷，并且成本較低。

本研究中，最大的2個(gè)ARDRA簇(第31簇和第18簇)均包含細(xì)莖石斛的內(nèi)生和根圍細(xì)菌。據(jù)此推測(cè)細(xì)莖石斛的內(nèi)生和根圍細(xì)菌之間存在一定的聯(lián)系，根圍細(xì)菌可能通過(guò)細(xì)莖石斛根部的自然孔洞或傷口進(jìn)入體內(nèi)，成為其體內(nèi)細(xì)菌的一部分。16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果表明：分離的75株內(nèi)生和根圍細(xì)菌菌株隸屬于8個(gè)屬，且芽孢桿菌屬菌株在細(xì)莖石斛體內(nèi)及根圍生境中均具有明顯優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)果與Tsavkelova等[6,22]的研究結(jié)果一致。此外，細(xì)莖石斛的根和莖中均存在特有的細(xì)菌種類(lèi)，如根中的微桿菌屬菌株、莖中的泛菌屬菌株等，說(shuō)明這些內(nèi)生細(xì)菌菌株可能具有組織特異性。

在本研究分離出的75株細(xì)莖石斛內(nèi)生和根圍細(xì)菌菌株中，4株假單胞菌屬菌株、3株芽孢桿菌屬菌株、1株賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬菌株和1株鏈霉菌屬菌株兼具解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素和嗜鐵素的能力，這9株菌株均具有釋放土壤中的磷和鉀元素、螯合鐵元素及產(chǎn)生長(zhǎng)素的能力，據(jù)此認(rèn)為這些菌株具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛能。此外，芽孢桿菌屬菌株DmB13雖然不具有解磷、解鉀和產(chǎn)嗜鐵素的能力，但是其產(chǎn)生長(zhǎng)素的能力最強(qiáng)，因此可將其作為進(jìn)一步促生實(shí)驗(yàn)的候選菌株。通常情況下，植物的生長(zhǎng)發(fā)育需要各種營(yíng)養(yǎng)元素，而其內(nèi)生和根圍細(xì)菌可通過(guò)固氮、溶磷、分泌植物激素(生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯等)等方式直接影響植物的新陳代謝[23-24]。另外，微生物產(chǎn)生的嗜鐵素對(duì)植物的鐵營(yíng)養(yǎng)調(diào)控也具有一定的作用，許多微生物分泌的嗜鐵素可作為缺鐵植物的鐵源[25]。因此，將具有良好促生潛力的細(xì)菌應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以在一定程度上替代化肥和農(nóng)藥[26]。

綜上所述，細(xì)莖石斛根和莖的內(nèi)生細(xì)菌、根圍苔蘚細(xì)菌和根圍土壤細(xì)菌種類(lèi)均較多(75株)且多樣性較豐富(8屬)，共分成33個(gè)ARDRA簇，以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌為主。其中，22株菌株兼具解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的能力、25株菌株具有解鉀能力、64株菌株具有產(chǎn)生長(zhǎng)素能力、39株菌株具有產(chǎn)嗜鐵素能力，共9株菌株兼具解磷、解鉀、產(chǎn)生長(zhǎng)素和嗜鐵素的能力，因此，可將這些菌株作為促進(jìn)細(xì)莖石斛生長(zhǎng)的候選菌株。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

Analyses on diversity and plant-growth-promoting ability of endophytic and rhizosphere bacteria ofDendrobiummoniliforme

ZHANG Li, TONG Wenjun, XUE Qingyun, DING Xiaoyu①

(College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 32-40

Endophytic bacteria from root, stem and leaf ofDendrobiummoniliforme(Linn.) Sw. collected from Yingshan County of Hubei Province， endophytic bacteria from rhizosphere moss and rhizosphere bacteria from rhizosphere soil of this species were separated, and these bacterium strains were identified and their diversity were analyzed by means of a combination method of amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and UPGMA cluster analysis. On these bases, abilities of solubilizing phosphorus, solubilizing potassium, producing auxin and siderophore of these bacterium strains were detected by plate detection technology. The results show that 75 bacterium strains are obtained from root and stem ofD.moniliformeand its rhizosphere moss and soil, endophytic bacterium is not isolated from leaf ofD.moniliforme. In which, endophytic bacteria from root and stem are 14 and 7 strains, respectively, those from rhizosphere moss are less only with 14 strains, bacterium strains from rhizosphere soil are the most with 40 strains. 75 strains are divided into 33 ARDRA clusters, by 16SrDNA sequencing and alignment, they are belonging to genera ofStreptomyces,Bacillus,Pseudomonas,Rahnella,Pandoraea,Microbacterium,LysinibacillusandPantoea, in which,BacillusandPseudomonasare the dominant genera. In 75 strains of endophytic and rhizosphere bacteria, 22 strains possess double abilities of solubilizing inorganic and organic phosphorus, 25 strains do solubilizing potassium ability, 64 strains do producing auxin ability and 39 strains do producing siderophore ability, in which, 9 strains possess all abilities of solubilizing phosphorus and potassium, producing auxin and siderophore. On the whole, endophytic and rhizosphere bacteria ofD.moniliformeare quantity with high diversity, in which, 9 strains with all of four plant-growth-promoting abilities can be used as candidate strains for promoting growth ofD.moniliforme.

Dendrobiummoniliforme(Linn.) Sw.; endophytic bacterium; rhizosphere bacterium; ARDRA analysis; diversity; plant-growth-promoting ability

2015-01-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(311703000)

張 禮(1988—)，女，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事植物內(nèi)生菌方面的研究。

①通信作者 E-mail： dingxynj@263.net

Q948.12+2.3; Q949.71+8.43

A

1674-7895(2015)03-0032-09

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.05