寧波副溶血性弧菌臨床株毒力基因與多位點序列分型研究

高 紅，宋啟發(fā)，徐景野，鄭 劍，沈玄藝

寧波副溶血性弧菌臨床株毒力基因與多位點序列分型研究

高 紅，宋啟發(fā)，徐景野，鄭 劍，沈玄藝

目的 了解寧波地區(qū)副溶血性弧菌臨床分離株毒力基因分布以及分子分型特征。方法 收集來源于食物中毒和散發(fā)腹瀉患者副溶血弧菌菌株，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測耐熱直接溶血素基因(tdh)和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素基因(trh)，利用多位點序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)進行分子分型。結(jié)果 2006—2012年共分離臨床株248株，選擇48株進行毒力基因和MLST分型研究。42株tdh+，為93.75%；11株trh+，為22.92%。48株菌株可分為9個ST型和一個未分型，ST3有32株，占66.67%； ST265有5株，占10.42%；ST120有3株，占6.25%。ST3克隆群中tdh+/trh-菌株有25株，占78.16%。與全國其他地區(qū)比較，在寧波臨床株中發(fā)現(xiàn)ST262。結(jié)論 tdh+型是寧波地區(qū)副溶血性弧菌優(yōu)勢菌株。有9種ST型，以ST3克隆為主，其次為ST265和ST120。ST3克隆中以tdh+/trh-型為主。另發(fā)現(xiàn)1個獨特的ST262菌株。

副溶血性弧菌；耐熱直接溶血素基因；耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素基因；多位點序列分型

Funded by the Ningbo Municipal Science & Technology Bureau (Nos.2012B82018 and 2011C50041)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP) 是革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，屬于弧菌科弧菌屬，廣泛存在于近海岸的海水、海水沉積物和魚蝦、貝類等海產(chǎn)品中及食品加工環(huán)境中[1]。1994—2005年在中國的細(xì)菌性食物中毒事件中副溶血性弧菌已居于首位[2]。2006-2011年浙江省共報告食物中毒突發(fā)事件106 起,以微生物類事件為主(占67.92%)，副溶血弧菌為最常見致病菌(占33.33%)[3]。2013年浙江省食源性疾病監(jiān)測項目中副溶血性弧菌檢出率最高，為3.7%，血清型以O(shè)3∶K6和O4∶K8為主。寧波市食源性疾病監(jiān)測項目顯示，副溶血性弧菌為散發(fā)性腹瀉的主要病原，2013年在992份糞便和肛拭子中檢測到50份陽性樣品，陽性率為5.04%。耐熱直接溶血素(Thermostable direct hemolysin, TDH)和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素 (TDH-related hemolysin, TRH)是其主要致病物質(zhì)，可引起腸袢腫脹、充血和腸液潴留而導(dǎo)致腹瀉[4-5]。目前在浙江省的副溶血性弧菌臨床株中發(fā)現(xiàn)了ST3、ST120和ST8[6]。為掌握寧波地區(qū)臨床株副溶血性弧菌毒力基因分布以及分子分型特征，特進行相關(guān)研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株分離 將食物中毒和急性腹瀉患者糞便或肛拭子直接接種TCBS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選可疑菌落進行革蘭染色、氧化酶試驗和觀察動力。動力陽性氧化酶試驗陽性的陰性弧采用法國生物梅里埃公司的VITEK-32儀器進行系統(tǒng)生化鑒定。

1.2 引物合成 tdh上游引物tdh-f: 5′- CGGTTCTGATGAGATATTGT-3′和下游引物tdh-r：5′- TCTGGAGTTTCATCCAAATA-3′,擴增產(chǎn)物為363 bp；trh基因上游引物trh-f：5′-TCAGTATCTAAATCATTCGC-3′和下游引物trh-r：5′-CATAACAAACATATGCCCAT-3′，擴增產(chǎn)物為471 bp；多位點序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)擴增和測序引物參考文獻[7]。

1.3 副溶血性弧菌基因組DNA的提取 采用Takara公司的MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(3.0版)，按照試劑說明書提取副溶血性弧菌基因組DNA。

1.4 tdh和trh檢測 采用Takara公司Premix TaqTM(2.0版) 試劑盒，按照試劑說明書配制PCR反應(yīng)體系。tdh擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。trh擴增條件：退火溫度為58 ℃，其余同上。取擴增產(chǎn)物10 μL點樣于1%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含溴化乙錠最終濃度為0.5 μg/mL)，電壓10 V/cm，電泳30 min，暗室內(nèi)紫外光下(波長254～365nm)觀察電泳結(jié)果，觀察是否有預(yù)期分子量大小的條帶出現(xiàn)。

1.5 副溶血性弧菌MLST擴增、測序和數(shù)據(jù)分析 副溶血性弧菌MLST方法參考文獻[7]，選擇副溶血性弧菌的7個管家基因adk、fumc、gyrB、icd、mdh、purA 和recA 進行PCR，擴增產(chǎn)物利用ABI3730全自動基因分析儀(上海英駿公司)采用測序引物對擴增的片段進行正反方向核苷酸序列測定，測序結(jié)果利用軟件Chromas編輯和拼接，利用軟件Bioedit進行校正，校正后的序列與副溶血弧菌MLST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)進行比對，獲得各管家基因的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型(sequence type,ST)。利用Mega6.0對7個管家基因核苷酸串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用eBURST V3軟件對ST進行分析。參考菌株來自副溶血弧菌MLST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié) 果

2.1 tdh和trh毒力基因分析 2006—2012年共分離到248株副溶血性弧菌臨床株，選擇48株菌株進行毒力基因和MLST分型研究，2006年10株，均來自于一起食物中毒事件，2007年8株，2009年10株，2010年6株，2011年5株，2012年9株。48株菌株中42株tdh+，為93.75%；trh+11株，為22.92%；9個菌株為tdh+/trh +，4個菌株為tdh-/trh-。

2.2 副溶血性弧菌MLST分型結(jié)果 48株菌株可分為10個ST型。ST為3的菌株有32株，占66.67%；其次為ST為265的菌株有5株，占10.42%；ST為120的菌株有3株，占6.25%。2012年分離的F2012289菌株7個管家基因的等位基因分別為dnaE234、gyrB4、recA162、dtdS222、pntA、pyrC184和tnaA79，在數(shù)據(jù)庫中無匹配的ST。菌株毒力基因分布與MLST分型結(jié)果見表1。

2.3 副溶血性弧菌臨床株eBURST V3軟件分析結(jié)果 從副溶血弧菌MLST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫選擇中國分離的副溶血性弧菌臨床株作為參照，利用eBURST V3軟件繪制菌株ST分布圖。數(shù)據(jù)庫中中國副溶血性弧菌臨床株共有105株，分為84個ST。其中ST為3的菌株有12株，占11.43%；ST為8的菌株有3株,占2.86%。在寧波臨床株中發(fā)現(xiàn)特殊的ST262，在全國其他地區(qū)臨床株中未出現(xiàn)。

2.4 7個管家基因連接序列Mega6.0軟件分析結(jié)果 47個能進行ST分型的菌株按照形成ST的順序?qū)?個管家基因連接成長度為3 682 bp的多基因序列，利用Mega6.0軟件采用Maximum Likelihood方法繪制系統(tǒng)進化樹。從圖中可知47株臨床株在進化樹上位于3個主要的分支上，7個管家基因中recA的變異最大。具體結(jié)果見圖2。

3 討 論

TDH具有溶血活性、細(xì)胞毒性、心臟毒性以及致死性等生物學(xué)活性，是副溶血性弧菌的主要毒力因子，與副溶血性弧菌的致病力具有高度相關(guān)性[4,8]。TRH具有溶血作用和腸毒素作用，是副溶血性弧菌的另一個重要的毒力因子。在48株寧波臨床株中tdh+為93.75%，占據(jù)優(yōu)勢地位，與菌株致病性高度相關(guān)；trh+為22.92%；9個菌株為tdh+ /trh+,這與多篇文獻報道的臨床分離株中大多為tdh+/trh-，少量為tdh+ trh+的實驗結(jié)果相一致[9-10]。4個菌株為tdh- /trh-，楊小蓉等對不攜帶tdh或trh的菌株進行小鼠毒力實驗, 表明不攜帶毒力基因的菌株也具有致病性[11]。因此僅僅根據(jù)能否檢測到tdh或trh毒力基因來判斷菌株是否具有致病性是錯誤的。

表1 副溶血性弧菌毒力基因和MLST分型結(jié)果

注：數(shù)字表示ST，綠色為寧波臨床株特有ST，黑色為全國臨床株ST，紅色為兩種來源均有。

全球副溶血性弧菌已經(jīng)有610種ST型，5種ST型最為常見(ST3、ST36、ST34、ST83和ST8)[7]。按照ST單點變異型(single-locus variant,SLV)值≥3為一個克隆群，具有最大SLV值的ST為主要起源，經(jīng)eBURST V3分析顯示，中國臨床株ST分布存在3個克隆群(ST3、ST120和ST345)，最大克隆群為ST3并且是主要起源克隆群(SLV=8)。從圖2可知ST3克隆群2006—2012年在寧波臨床株中一直處于優(yōu)勢地位，與以上結(jié)果保持一致。2006年分離的9個菌株來自于一起食物中毒事件，這9個菌株均為tdh+/trh-菌株，且ST均為3，本研究表明該起食物中毒可能由單一ST菌株引起。

注：菌株名稱前數(shù)字為ST,右側(cè)條圖黑線表示與1號菌株相比該處核苷酸有差異。

與全國其他地區(qū)臨床株比較，寧波有1個特殊的ST262。ST262菌株分離自2011年，只有1株，在副溶血弧菌MLST標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中查詢得知，該型菌株1984年首次在日本腹瀉病人中分離到，1990年和1991年在泰國腹瀉病人中檢出，在我國是首次報道分離到該型菌株。ST265菌株在1990年泰國腹瀉病人和2007年中國環(huán)境中分離到，在2007—2012年深圳的食源性疾病監(jiān)測中127株副溶血性弧菌中有14株ST265[12]。本次研究在48株菌株中檢測到5株，分離年份為2007年、2009年、2010年和2012年，說明該型菌株除了在環(huán)境中存在外，還能在腹瀉病人中流行。ST265屬于ST345克隆群，而寧波和深圳均未發(fā)現(xiàn)ST345菌株，ST265可能是ST345克隆群在中國的主要流行株。

寧波地處我國東部沿海，這里的人們喜歡生吃半生吃各種小海產(chǎn)品，是副溶血性弧菌感染的高發(fā)區(qū)，與臨近的日本、泰國等地交流頻繁，因此掌握副溶血弧菌分子流行特征對副溶血弧菌的主動監(jiān)測、暴發(fā)調(diào)查和追蹤溯源具有十分重要的意義。

[1]Su YC, Liu C.Vibrioparahaemolyticus: A concern of seafood safety[J]. Food Microbiol, 2007, 24(6): 549-558. DOI: 10.1016/j.fm.2007.01.005

[2]Wang S, Duan H, Zhang W, et al. Analysis of bacterial foodborne disease outbreaks in China between 1994 and 2005[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2007, 51(1): 8-13. DOI: 10.1111/j.1574-695X.2007.00305.x

[3]Zhao YR, Wang Z, Liu BY, et al. Epidemiology of food poisoning in Zhejiang province, 2006-2011[J]. Dis Surveillance, 2012, 27(4): 307-310. (in Chinese) 趙艷榮, 王臻, 劉碧瑤, 等. 2006—2011年浙江省食物中毒事件流行病學(xué)特征和趨勢分析[J]. 疾病監(jiān)測, 2012, 27(4): 307-310.

[4]Nishibuchi M, Ishibashi M, Takeda Y, et al. Detection of the thermostable direct hemolysin gene and related DNA sequences inVibrioparahaemolyticusand otherVibriospecies by the DNA colony hybridization test[J]. Infect Immun, 1985, 49(3): 481-486.

[5]Honda T, Abad-Lapuebla MA, Ni YX, et al. Characterization of a new thermostable direct haemolysin produced by a Kanagawa-phenomenon-negative clinical isolate of Vibrio parahaemolyticus[J]. J Gen Microbiol, 1991, 137(2): 253-259. DOI: 10.1099/00221287-137-2-253

[6]Han DS, Chen X, Li ZJ, et al. Prevalence and multi-locus sequence typing ofVibrioparahaemolyticusassociated with acute diarrhea in Zhejiang[J].J Environ Health, 2012,29(10):917-919. (in Chinese) 韓東升, 陳曉, 李中杰, 等. 浙江省急性腹瀉副溶血弧菌的流行及多位點序列分型分析[J]. 環(huán)境與健康雜志,2012,29(10):917-919.

[7]Public databases for molecular typing and microbial genome diversity [EB/OL].[2014-07-16]http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/

[8]Nichuchi M, Kaper JB. Thermostable direct hemolysin gene ofVibrioparahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium[J]. Infect Immun, 1995, 63(6): 2093-2099.

[9]Zhang LP, Lu GJ, Yin YM, et al. Analysis of virulence gene ofVibrioparahaemolyticusfrom 2006 to 2008 in Dongguan[J]. Chin J Health Lab Technol, 2010, 20(3): 563-564. (in Chinese) 張莉萍, 陸冠錦, 尹艷梅,等. 2006—2008東莞市副溶血性弧菌毒力因子分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010, 20(3):563-564.

[10]Zhang C, Gao X, Zhen BJ, et al. Analysis of PFGE molecular typing,toxin genes and antibiotics resistance in Vibrio parahaemolyticus[J]. Chin J Health Lab Technol, 2013, 23(4): 1015-1021.(in Chinese) 張沖, 高翔, 甄博珺, 等. 副溶血弧菌PFGE分型、毒力基因及其耐藥性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2013, 23(4): 1015-1021.

[11]Yang XR, Li WW, Zhao J, et al. The serotype, virulence genes and molecular type ofVibrioparahaemolyticusin Sichuan Province in 2009[J].J Prev Med Infect, 2013, 29(1): 25-29. (in Chinese) 楊小蓉, 李薇薇, 趙晉, 等. 2009年四川省副溶血性弧菌血清型、致病力及分子分型研究[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志, 2013,29(1):25-29.

[12]Li Y, Xie X, Shi X, et al.Vibrioparahaemolyticus, Southern Coastal Region of China, 2007-2012[J]. Emerg Infect Dis, 2014, 20(4): 685-688. DOI: 10.3201/eid2004.130744

Virulence gene detection and multi-locus sequence typing ofVibrioparahaemolyticusfrom patients in Ningbo, China

GAO Hong,SONG Qi-fa,XU Jing-ye,ZHENG Jian,SHEN Xuan-yi

(NingboCenterforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315010,China)

To investigated the toxin genes distribution and molecular characteristics ofVibrioparahaemolyticusfrom patients in Ningbo,V.parahaemolyticusstrains were collected from patients with food poisoning and diarrhea. Thermostable direct hemolysin gene (tdh) and TDH-related hemolysin gene (trh) were detected by polymerase chain reaction (PCR). Molecular characteristics were acquired by multi-locus sequence typing (MLST). Of 248 clinical strains were isolated from 2006 to 2012. Forty-eight strains were selected to detect virulence genes and MLST genotyping. Forty-two isolates were detected as tdh+ and 11 isolates were detected as trh+. There were 9 STs and one undifferentiated type in Ningbo clinical strains. Thirty-two strains were classified into ST3, 5 strains into ST265 and 3 strains into ST120. ST265 was found in Ningbo strains compared with strains from other regions of China. Strains with tdh+ accounted for the majority in Ningbo clinical strains. Twenty-five strains of ST3 clone were tdh+/trh-. There were 9 STs coexsited in Ningbo clinical strains. ST3 clone was dominant, followed by ST265 and ST120. Strains with tdh+/trh- were dominant in the ST3 clone. The unique ST262 was found in Ningbo clinical strains.

Vibrioparahaemolyticus; tdh; trh; multi-locus sequence typing

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.011

寧波市科學(xué)技術(shù)局基金項目資助(No.2012B82018，No.2011C50041)

寧波市疾病預(yù)防控制中心，寧波 315010; Email：gaohong@nbcdc.org.cn

R378.3

A

1002-2694(2015)03-0240-04

2014-07-16；

2014-09-24