遼寧省炭疽芽胞桿菌MLVA分型研究

毛玲玲，田 疆，雷 露，劉學升，張 巍，張眉眉，韓 悅，姚文清

遼寧省炭疽芽胞桿菌MLVA分型研究

毛玲玲1，田 疆1，雷 露1，劉學升1，張 巍2，張眉眉1，韓 悅1，姚文清1

目的 了解遼寧地區(qū)炭疽芽胞桿菌的流行特征及菌型基因特征。方法 通過多位點可變數目串聯(lián)重復序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA)分型實驗，對2001—2011年遼寧省分離到的6株炭疽芽胞桿菌分離株DNA進行檢測，DNA指紋圖譜使用BioNumerics 4.0 軟件進行統(tǒng)計分析，得出聚類分析結果。結果 聚類分析發(fā)現(xiàn)，6株炭疽芽胞桿菌株可分為2個基因型。對于炭疽暴發(fā)而言，其可變數目串聯(lián)重復序列遺傳標記具有高度相似性。結論 炭疽芽胞桿菌基因組中的串聯(lián)重復序列可作為炭疽芽胞桿菌基因分型的指標，在炭疽暴發(fā)事件中的病原體溯源上具有重要的意義。

炭疽芽胞桿菌；多位點可變數量串聯(lián)重復序列分析；基因分型

炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)引起的一種人獸畜共患傳染病，對農業(yè)和人類造成嚴重損害[1]。人類主要是通過接觸患畜、進食感染炭疽的牲畜肉類、吸入含有菌體或芽胞的氣溶膠、塵埃以及接觸污染病菌的皮毛而感染本病。炭疽芽孢桿菌耐受不良環(huán)境的能力及其傳染性和強致病性，使其成為首選的生物戰(zhàn)劑之一，曾多次被恐怖分子用來發(fā)動生物恐怖襲擊。

多位點可變數目串聯(lián)重復序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA)[2]是近年發(fā)展起來的以PCR 為基礎，根據被檢菌株散在于基因組中不同位點的、變數量串聯(lián)重復序列(variable number tandem repeat，VNTR)的重復單元拷貝數的差異來進行分子分型的技術。Keim等選擇炭疽芽胞桿菌6個染色體上的VNTR位點和2個質粒上的VNTR位點建立了MLVA-8[3]。歷史上遼寧省很多地區(qū)都發(fā)生過炭疽疫情，并于近十年間多次發(fā)生較大規(guī)模暴發(fā)疫情，尤其是發(fā)生于2011年的炭疽疫情，波及我省2個地市，發(fā)病人數達30多例。為了解遼寧地區(qū)炭疽芽胞桿菌的流行特征及菌型基因特征，采用MLVA分型方法對遼寧省10年間分離到的6株炭疽芽胞桿菌進行基因分型研究。

1 材料與方法

1.1 材料 2001—2011年間，遼寧省分離自病人、外環(huán)境的6株炭疽芽胞桿菌分離株，經生化、藥敏及噬菌體鑒定。菌株詳細資料見表1。

1.2 主要儀器與試劑 核酸提取應用QIAGEN EZ1全自動核酸提取工作站，引物、Premix Ex Taq均由大連寶生物技術有限公司提供，PCR產物測序工作由北京英俊生物工程技術服務有限公司完成。

1.3 方法 采用MLVA-8(8位點可變數目串連重復序列)分型方法，引物序列、擴增體系及反應條件見文獻[1，3]，表2。MLVA反應體系包括10×緩沖液(Mg2+1.5 mol/L)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.5 μL，引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，用滅菌蒸餾水補至25 μL。擴增參數：95℃預變性5 min，然后以95 ℃變性20 s、60 ℃退火20 s、65 ℃延伸3 0s，進行34個循環(huán)，末輪65 ℃延伸5 min。PCR產物由北京英俊生物工程技術服務有限公司進行測序，得到產物片段的大小。

1.4 數據分析 根據PCR產物大小，采用Bio Numerics 4.0軟件，利用非加權配伍組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)聚類分析。

表1 菌株背景資料

表2 炭疽芽胞桿菌MLVA-8引物序列

2 結 果

采用MLVA-8分型方法(vrrA、vrrB1、vrrB2、vrrC1、vrrC2、CG3、pxO1、pxO2)對6株炭疽芽胞桿菌進行分析。根據其產物大小聚類分析發(fā)現(xiàn)，6株炭疽芽胞桿菌株可聚類為2個基因型(見圖1)。基因1型中包含2株菌，分離于2011年暴發(fā)疫情的2個病例?；?型中包含分離自兩個地區(qū)不同年份的4株炭疽菌。

3 討 論

目前，基因分型技術廣泛應用于各種病原微生物的研究，MLVA方法是眾多基因分型方法中較為成熟的一種[2]。MLVA具有快速簡便、分辨力高和重復性好、結果易于數字化的特點。目前該方法已廣泛應用于鼠疫耶爾森菌、結核分枝桿菌[2]、布魯氏菌以及腸炎沙門菌等一些細菌的分型分析。由于炭疽芽孢桿菌遺傳變異水平低的特點，MLVA是少數幾種可用于鑒別炭疽芽孢桿菌菌株之間差異的分子分型方法。Keim等[3]選擇炭疽芽胞桿菌6個染色體上的VNTR位點和2個質粒上的VNTR位點建立MLVA-8后，對全世界各地所分離的426株炭疽芽孢桿菌進行MLVA分析，鑒定出89個基因型，聚類分析分為6個主要基因群，其中A3集群分布非常普遍。我國王秉翔等[1]用MLVA8分析來自中國的193株炭疽芽孢桿菌菌株，并揭示了21種新的基因型；聚類分析顯示A、B、C等3個集群。魏建春等[4]選取11個位點，對109株來自全國的炭疽菌株進行了分析，結果提示新疆的菌株類型較復雜。

圖1 6株炭疽芽胞桿菌MLVA聚類分析圖

本研究采用炭疽芽胞桿菌MLVA-8分型引物，對我省的炭疽芽胞桿菌進行分析。結果表明， 6株炭疽芽胞桿菌株可聚類為2個基因型，將其基因型與Keim[3]的結果相對照，均屬于常見的A3集群，該集群在我國分布最為廣泛。對照王秉翔[1]的研究結果，基因1型曾在北京、廣西、河北、山東、新疆的炭疽分離株中發(fā)現(xiàn)，在遼寧發(fā)現(xiàn)此基因型尚屬首次。本次研究中的基因2型與王秉翔[1]的研究結果一致。有4株分離株聚類到基因2型中，這4株菌分離于兩個地區(qū)的不同年份，該基因型是否為遼寧本地主要流行型別尚待進一步監(jiān)測研究證實。本次研究中的1、2、3號分離株來源于2001年的暴發(fā)疫情及其監(jiān)測，5、6號分離株分離于2011年同一起暴發(fā)疫情的2個病例，相同暴發(fā)疫情的分離株同源性達100%，因此對于暴發(fā)疫情分離到的炭疽菌株而言，其可變數目串聯(lián)重復序列遺傳標記具有高度相似性。

MLVA技術在炭疽感染事件中追溯傳染源，甚至菌株的鑒定方面，是一種很好的分析方法。2001年美國“9.1l”炭疽恐怖事件，Hoffmaster等[5]應用MLVA技術分析了來自炭疽事件標本分離到的135株菌，所有的菌株都為同一基因型，并且與實驗室使用的Ames菌株一致。Keim等[3]應用MLVA技術對日本奧姆真理教炭疽事件中的菌株進行了回顧性研究，發(fā)現(xiàn)48株菌有一致的基因型，與Sterne菌株的基因型一致。

綜上所述，通過MLVA分析可以從分子流行病學角度及時發(fā)現(xiàn)暴發(fā)疫情。對傳染源的追蹤，暴發(fā)流行調查、生物恐怖事件病原體的溯源具有重要的作用。因此建立我省的炭疽芽胞桿菌菌株MLVA數據庫資料，對于炭疽的防控、打擊恐怖主義和反生物武器具有重要意義。

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[2]Barlow RE, Gascoyne-Binzi DM, Frothingham R, et al. Rapid identification of laboratory contamination withMycobacteriumtuberculosisusing variable number tandem repeat analysis[J] . J Clin Microbiol, 2001, 39(1): 69-74. DOI: 10.1128/JCM.39.1.69-74.2001

[3]Keim P, Price LB, Klevytska AM, et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships withinBacillusanthracis[J]. J Bacterio1, 2000, 182(10): 2928-2936. DOI: 10.1128/JB.182.10.2928-2936.2000

[4]Wei JC, Zhang EM, Zhang HJ, et al. Characteristics and distribution of 11 variable number tandem repeats ofBacillusanthracisin China[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(8): 765-768. (in Chinese) 魏建春, 張恩民, 張慧娟, 等. 中國炭疽芽胞桿菌中11個串聯(lián)重復序列位點的特征和分布[J] . 中國人獸共患病學報, 2012, 28(8)：765-768.

[5]Hoffmaster AR, Fitzgerald CC, Ribot E, et al. Molecular subtyping ofBacillusanthracisand the 2001 bioterrorism--associated anthrax outbreak, United States bioterrorism-related anthrax[J]. Emerg Infect Dis, 2002, 8(10): 1111-1116.

Bacillusanthracisisolates analysis by multiple-locus variable-numbers of tandem repeats analysis, Liaoning, China

MAO Ling-ling1,TIAN Jiang1,LEI Lu1,LIU Xue-sheng1, ZHANG Wei2,ZHANG Mei-mei1,HAN Yue1,YAO Wen-qing1

(1.LiaoningCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenyang110005,China; 2.AnshanCenterforDiseaseControlandPrevention,Anshan114009,China)

The epidemic characteristics and genotype ofBacillusanthracisstrains in Liaoning Province, China was analyze in this study. SixBacillusanthracisstrains from 2001 to 2011 were studied with multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA). BioNumerics4.0 software was used to analyze the DNA fingerprint of statistics, and cluster analysis results were obtained. Clustering analysis found that the 6 strains could be divided into two genotypes. For anthrax outbreaks, the genetic markers of multiple-locus variable-number tandem repeat were highly similar. It's suggested that MLVA is quite useful for investigation of strain relatedness in regions of outbreaks.

Bacillusanthracis; multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis; genotype

Yao Wen-qing, Email: yaowenqing@lncdc.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.009

國家科技重大專項 艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治項目(2012ZX10004-209)

姚文清， Email: yaowenqing@lncdc.com

1.遼寧省疾病預防控制中心， 沈陽 110005； 2.鞍山市疾病預防控制中心,鞍山 114009；

R378.7

A

1002-2694(2015)03-0232-03

Supported by the National Sci-Tech Key Project of China (No. 2012ZX10004-209)

2014-05-29；

2014-10-09