交叉引物恒溫擴增法檢測甲型H1N1流感病毒及臨床應用

白志軍，胡 林，李魁彪，鐘華燕，陳藝韻，魯恩潔，狄 飚

交叉引物恒溫擴增法檢測甲型H1N1流感病毒及臨床應用

白志軍1，胡 林2，李魁彪1，鐘華燕2，陳藝韻1，魯恩潔1，狄 飚1

目的 建立交叉引物恒溫擴增(Cross Priming Amplification, CPA)技術對甲型H1N1流感病毒進行檢測的方法，并對該方法通過臨床標本進行評價。方法 根據(jù)甲型H1N1流感病毒的保守序列設計特異性引物，并在同一溫度下實現(xiàn)RNA的逆轉錄和DNA擴增，該擴增產(chǎn)物可通過全封閉式核酸檢測裝置進行檢測。14份健康人咽拭子標本、7個其他呼吸道病毒和6個蟲媒病毒株被用來檢測CPA反應的特異性；已知病毒滴度的甲型H1N1毒株進行對照梯度稀釋，以測試CPA的敏感性；102份甲型H1N1臨床咽拭子標本為檢測對象，評估其臨床的檢測的可行性。結果 CPA反應未出現(xiàn)對健康樣本以及其他病毒產(chǎn)生交叉反應；對已知滴度的病毒進行梯度稀釋檢測，證明CPA的敏感性為10拷貝/μL 。對甲型H1N1流感臨床病例發(fā)病1～3 d臨床標本新建檢測方法的檢出率為100%，4～6 d臨床標本檢出率為79.31%，≥7 d臨床標本檢出率為9.09%。討論 CPA具有較高的敏感性、特異性，對設備要求低，適合基層醫(yī)療單位對甲型H1N1流感發(fā)病早期診斷使用。

甲型H1N1流感病毒；交叉引物恒溫擴增技術；臨床應用

2009年3月，甲型H1N1流感始于北美，迅速在全世界蔓延，中國大陸已經(jīng)普遍流行近年各地均有報告甲型H1N1 流感病例[1-2]。對于H1N1疫情防控策略的制定，實驗室檢測是比較有效的辦法。目前，實驗室檢測最快捷、有效的方法是熒光定量PCR，在但熒光定量PCR法需要價格昂貴的熒光定量PCR儀，檢測成本較高，且不易在基層醫(yī)院和防疫部門推廣，也不便于現(xiàn)場病原檢測的使用。因此，建立適合疫情現(xiàn)場檢測所需的，且不需特殊儀器的，費用低廉的甲型H1N1流感病毒的核酸檢測技術就顯得尤為重要。本研究結合了交叉引物恒溫擴增技術(Cross Priming Amplification, CPA)、核酸檢測試紙條技術和全封閉式核酸檢測裝置，建立了快速檢測甲型H1N1流感病毒特異性核酸的方法。使得RNA的逆轉錄以及DNA擴增能在同一個溫度實現(xiàn)，而擴增后的核酸產(chǎn)物可以用一個含有核酸試紙條的全封閉式核酸檢測裝置進行檢測。

1 材料與方法

1.1 標本來源及其診斷標準 2009年8月至2010年9月廣州市疾病預防控制中心收集甲型H1N1流感病毒疑似感染患者咽拭子標本102份和健康人咽拭子標本14份，以及實驗室保存的甲型流感病毒H3亞型、副流感病毒、禽流感H7N9亞型病毒、乙型流感病毒BV、BY亞型病毒和腺病毒等其他7株呼吸道病毒。廣州軍區(qū)疾病預防控制中心保存并提供西尼羅病毒、流行性乙型腦炎(乙腦)病毒、黃熱病毒；西門利克病毒、基孔肯雅病毒和辛德畢斯病毒等6株蟲媒病毒；所有咽拭子標本按照《WS285-2008流行性感冒診斷標準》進行常規(guī)處理后，均接種MDCK細胞進行病毒分離培養(yǎng)，并用中國疾病預防控制中心國家流感中心提供的鑒定血清進行血凝抑制試驗，鑒定其型別與亞型。經(jīng)鑒定甲型H1N1流感疑似標本均為陽性，健康人標本均為陰性。

1.2 主要試劑和儀器 Bst DNA聚合酶購自NEB公司、反轉錄酶購自杭州博日科技有限公司、病毒核酸提取試劑盒購自Qiagen公司，含有核酸試紙條的全封閉式核酸檢測裝置由杭州尤思達生物技術有限公司提供[3]。

1.3 CPA檢測

1.3.1 病毒核酸提取 使用病毒核酸提取試劑盒，按照說明書程序從140 μL標本和病毒液中提取50 μL RNA并于-80 ℃保存。

1.3.2 CPA引物的設計及反應原理 CPA擴增主要包含以下幾個步驟，如圖1所示：

①交叉正向引物CPF中的PFs與模板DNA中PFa互補，啟動DNA合成，使得PRa被引入到所擴增的產(chǎn)物中；

②外圍引物DP1s與PFa前端DP1a序列互補，通過鏈置換型DNA聚合酶向前延伸，一邊置換CPF合成的能與CPR和DP2a結合的單鏈產(chǎn)物(結構3)，一邊與模板DNA形成雙鏈產(chǎn)物(結構2)；

③在結構3中，DP2a通過鏈置換型DNA聚合酶向前延伸，置換出由CPR所延伸的單鏈產(chǎn)物(結構5)，同時合成與步驟2中由CPF延伸所產(chǎn)生單鏈DNA形成雙鏈產(chǎn)物(結構4)；

④單鏈結構5中的3′端的PFa和PRs可分別與CPF中的PFs和CPR中的PRa互補結合， 可在鏈置換型DNA聚合酶的作用下延伸和置換出相應的單鏈產(chǎn)物(結構8)；

⑤擴增引物CPF和CPR的不斷雜交和延伸；，DNA拷貝數(shù)不斷的增加，從而達到基因擴增的效果。

1.3.3 CPA反應體系 針對甲型H1N1流感病毒的HA基因保守區(qū)設計特異性引物，其中兩條特異性檢測探針分別帶有生物素標記和熒光素標記，引物見表1。CPA反應體積為20 μL，其中包括正向外圍引物0.3 μmol/L，反向外圍引物0.1 μmol/L，正向交叉引物2.0 μmol/L，反向交叉引物0.6 μmol/L，檢測探針各0.6 μmol/L；0.4 mmol/L dNTP；12U Bst酶 DNA聚合酶，2U反轉錄酶和4 μL RNA核酸模板。恒溫反應溫度為60 ℃,90 min。

1.4 CPA結果判定 CPA反應結束后，按照含核酸試紙條的全封閉式核酸檢測裝置的操作說明書進行操作[4-5]。室溫靜止15～30 min，當檢測裝置中的核酸免疫試紙條在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)顯示兩條紅色條帶，結果為陽性；檢測區(qū)沒有紅色條帶而質(zhì)控區(qū)顯示紅色條帶，結果為陰性。

2 結 果

2.1 CPA的敏感性 CPA 反應分別對病毒滴度為2.25 × 107PFU /mL的H1N1病毒分離培養(yǎng)液進行10倍梯度稀釋檢測，每個稀釋度重復3次試驗，結果顯示檢測敏感度為10拷貝/μL。

圖1 交叉引物設計及反應原理

2.2 CPA的特異性 CPA反應對甲型流感病毒H3亞型、副流感病毒、禽流感H7N9亞型病毒、乙型流感病毒BV、BY亞型病毒、腺病毒、西尼羅病毒、流行性乙型腦炎(乙腦)病毒、黃熱病毒、西門利克病毒、基孔肯雅病毒和辛德畢斯病毒等13種病毒的檢驗沒有交叉反應，結果為陰性。14份健康人標本檢測結果為陰性。

2.3 CPA對臨床標本的診斷 將以上CPA法檢測完成的102份陽性H1N1患者臨床標本，均通過MDCK細胞進行病毒分離成功。細胞分離陽性率為100%，以細胞分離法為標準，CPA法的檢出率為84.3%(86/102)，按照發(fā)病后不同采集時間進行數(shù)據(jù)分析。可見發(fā)病1～3 d CPA法檢出率為100%(62/62)；4～6 dCPA法檢出率為79.31%(23/29)，漏檢率為20.69%(6/29)；≥7 d CPA法檢出率為9.09%(1/11)，漏檢率為90.9%(10/11)，數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 檢測甲型H1N1流感病毒CPA系統(tǒng)的引物序列

表2 CPA方法和MDCK細胞分離病毒方法檢測結果

3 討 論

甲型H1N1流感自2009年到現(xiàn)在流行期間，國內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)了許多針對新甲型H1N1流感不同的快速檢測方法，主要是熒光定量PCR法和膠體金免疫層析法[6-11]。由于熒光定量PCR法需要價格昂貴的熒光定量PCR儀，檢測成本較高，不易在基層醫(yī)院和防疫部門推廣，也不便于現(xiàn)場病原檢測的使用。膠體金免疫層析法檢測的敏感性仍有一定的局限性。

CPA是一種新型的核酸恒溫擴增技術，能對基因在60℃的條件下同時實現(xiàn)RNA的逆轉錄以及DNA的擴增，而通過恒溫擴增得到的產(chǎn)物可以利用含核酸試紙條的全封閉式核酸檢測裝置進行檢測并降低擴增物的交叉污染[12]。目前，CPA已經(jīng)成功的運用到細菌和病毒的核酸檢測當中，如結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)和新布尼亞病毒(novelbunyavirus)，并且已經(jīng)被證明具有高度的特異性和敏感性[13-15]。在本研究中，我們通過對CPA恒溫擴增技術和核酸試紙條檢測技術的結合建立了一整套檢測甲型H1N1流感病毒的技術。

通過對已知濃度的H1N1病毒株進行10倍濃度梯度稀釋，CPA的檢測下限為10拷貝/μL。CPA對7株呼吸道癥候群病毒和6株蟲媒病毒的檢測結果，證明了其具有較高的特異性。雖然本研究以細胞分離法為標準，CPA法的檢出率僅為84.3%(86/102)，但如果我們對不同發(fā)病時段采集的臨床標本檢測數(shù)據(jù)分析顯示，CPA方法對發(fā)病后1～3 d的咽拭子標本陽性檢出率最高為100%；隨后4～6 d和7 d以后的的標本檢出率逐漸下降。咽拭子標本中抗原檢出情況完全符合機體對病原免疫應答的規(guī)律，在發(fā)病1～3 d因為機體免疫系統(tǒng)還未大量產(chǎn)生可中和病毒的抗體，故CPA檢測的陽性檢出率較高；發(fā)病4 d后，機體產(chǎn)生的特異性IgM和IgG逐漸發(fā)生中和作用，降低了血清中的病毒載量，故CPA法陽性檢出率逐漸下降。在本項研究發(fā)病后1～3 d標本檢測數(shù)據(jù)中，CPA方法和病毒細胞分離2種檢測方法檢測結果之間一致性較好，可見CPA適合于甲型H1N1流感臨床發(fā)病早期的診斷。

CPA在實際操作還是在儀器要求方面，都比傳統(tǒng)的RT-PCR或者real-time RT-PCR技術更為簡單。同時利用全封閉式核酸檢測裝置，不僅避免了靶核酸擴增物釋放到空氣中形成污染，同時還可通過顯色判讀結果，降低了對操作人員的要求。利用CPA檢測甲型H1N1流感具有高較好的特異性和靈敏性，適用疾病防控的第一防線基層哨點部門或現(xiàn)場工作中，因此CPA 技術更具備廣泛的應用前景。此次我們對CPA技術在甲型H1N1流感檢測中的應用和評估，也為今后該技術的推廣利用積累了實驗室經(jīng)驗，將會在疾病的早期診斷及預防控制方面發(fā)揮重要作用。

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Establishment of cross priming amplification for influenza A virus (H1N1) and its clinical application

BAI Zhi-jun1,HU Lin2,LI Kui-biao1,ZHONG Hua-yan2,CHEN Yi-yun1,LU En-jie1,DI Biao1

(1.GuangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Guangzhou510440,China; 2.UstarBiotechnologies(Hangzhou)Co.,Ltd.,Hangzhou310012,China)

In this study, we established Cross Priming Amplification (CPA) technology for detection of influenza A virus (H1N1) approach, and evaluated the method through clinical specimens. A set of specific primers were designed for CPA according to the conservative gene sequences, designed and realized in the same temperature reverse transcription of RNA and DNA amplification. The amplification products can be totally enclosed nucleic acid detection device for testing. Fourteen healthy pharyngeal swab specimens, seven other respiratory viruses, and six arboviruses strains were used as the controls. We used a method that application of gradient dilution to the H1N1 virus strain as the control to test the sensitivity of the CPA. We also used 102 clinical pharyngeal swab specimens of H1N1 patients for detection object to evaluate the feasibility of CPA clinical detection. Results showed that the CPA reaction did not appear cross reaction on health cases samples and other viruses. The sensitivity of the CPA was approximately 10 copies/uL in the established method that exactly titer H1N1 virus strain gradient dilution test. As to the positive results among the clinical pharyngeal swab samples collected from patients at different stages after onset, the CPA had the highest positive detection rate during the first three days after onset (100%). While the detection rate from day 4 to day 6 after onset was 79.31%. After 7 days, the detection rate was 9.09%. The established CPA assay was a highly sensitive, specific and reproducible approach for rapid detection of H1N1 virus, which is conducive to the early diagnosis of influenza A virus (H1N1) for basic medical units.

influenza A virus(H1N1); cross priming amplification (CPA); clinical application

Di Biao, Email: biao65di@yahoo.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.004

國家科技重大專項(2012ZX10004-213-005)，廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(20131A011115，201102A212006)，廣州市科技和信息化局項目(2012Y2-00020)，廣東省科學技術廳項目(2012B040304002)，廣州市醫(yī)學重點學科建設項目(2013-2015-07)聯(lián)合資助

狄飚，Email: biao65di@yahoo.com

1.廣州市疾病預防控制中心，廣州 510440 2.杭州優(yōu)思達生物技術有限公司，杭州 310012

R373.1

A

1002-2694(2015)03-0208-04

2014-06-24；

2014-11-30

Supports by grants from the National Science and Technology Major Project of China (No. 2012ZX1004-213-005), the Science and Technology Program of Guangzhou Health Department (Nos. 20131A011115, and 201102A212006), the Guangzhou Science and Technology Department Program (No. 20121Y2-00020), the Science and Technology Program of Guangdong Province (No. 2012B040304002), and the Project for Key Medicine Discipline Construction of Guangzhou Municipality (No. 2013-2015-07)