IL-17F及IL-17A基因多態(tài)性與中國四川漢族人群多發(fā)性硬化的相關(guān)性

付紅梅 王寅旭 王曉明 羅家明

IL-17F及IL-17A基因多態(tài)性與中國四川漢族人群多發(fā)性硬化的相關(guān)性

付紅梅 王寅旭 王曉明 羅家明

目的 探討中國四川漢族人群中白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-17A多態(tài)位點rs2275913及IL-17F基因多態(tài)位點rs763780與多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)發(fā)病的相關(guān)性。方法 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的MS患者126例，以176名性別年齡相匹配的健康體檢者為對照，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法來檢測rs2275913及rs763780多態(tài)位點的等位基因及基因型頻率分布，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 MS患者IL-17F基因rs763780位點TT基因型頻率(84.92%)高于健康對照組(71.01%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(校正后P=0.036)?；颊逿等位基因頻率(92.06%)亦高于正常人(84.66%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(校正后P=0.048)。MS患者IL-17A位點rs2275913的基因型頻率及等位基因頻率與健康對照者相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 IL-17F基因多態(tài)位點rs763780與MS相關(guān)，TT基因型及T等位基因可能是中國四川漢族人群MS發(fā)生的危險因素。IL-17A位點rs2275913同四川漢族人MS發(fā)病無相關(guān)。

多發(fā)性硬化；白細(xì)胞介素-17；多態(tài)性,單核苷酸

多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)是一種伴有軸突損傷、神經(jīng)退行性變、由T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，系歐美國家青年致殘的常見病。近年來，中國MS發(fā)病率也呈逐年遞增趨勢。MS的發(fā)病機制尚未完全闡清，可能與遺傳易感性、自身免疫及環(huán)境因素等多種因素相關(guān)。其中，遺傳易感性是極為重要的機制[1]。近年來國內(nèi)外不斷有研究表明白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17F和IL-17A基因多態(tài)在炎癥性疾病中起重要作用[2-4]。其中IL-17F多態(tài)位點rs763780具有生物學(xué)功能，是IL-17的天然拮抗劑，并被證實同視神經(jīng)髓鞘炎等脫髓鞘疾病相關(guān)[2]。而IL-17A多態(tài)位點rs2275913同樣被證實在亞洲人群中同炎性反應(yīng)性疾病相關(guān)[4]。目前國內(nèi)對IL17多態(tài)與MS的關(guān)系則較少報道。本研究對IL-17F多態(tài)位點rs763780及IL-17A多態(tài)位點rs2275913同中國四川地區(qū)MS發(fā)病的相關(guān)性進(jìn)行了探討。

1 對象和方法

1.1 臨床資料 選取2009-06-2012-09在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的MS患者126例，所有患者均依據(jù)修訂后2005年McDonald標(biāo)準(zhǔn)[5]評估臨床體征，并結(jié)合實驗室檢查及影像學(xué)檢查結(jié)果確診。其中男38例、女88例，年齡22～68歲，平均年齡(40.9±7.2)歲，均為四川籍漢族人。對照組為至川北醫(yī)學(xué)院體檢中心進(jìn)行常規(guī)體檢的健康者，其中男56名、女120名，年齡27～67歲，平均年齡為(41.2±6.3)歲，對照組也均為四川漢族人。所有對照人員同患者無血緣關(guān)系，并經(jīng)詳細(xì)詢問病史，排除自身免疫病史、腫瘤病史、感染病史、家族疾病史以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。該研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有參與本研究的患者和健康人均被書面告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書。兩組年齡及性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1DNA抽提：抽取所有研究對象外周靜脈血5mL，置于EDTA抗凝管內(nèi)，儲存于-20℃冰箱內(nèi)備用。采用QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen,Valencia,CA) 試劑盒，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)提取說明抽提全DNA，提取完成的DNA按體積稀釋10倍后作為工作濃度存放于4℃冰箱備用。

1.2.2 基因多態(tài)性分析：PCR反應(yīng)引物利用PrimerPremier5軟件設(shè)計，由上海英濰捷基(Invitrogen)生物公司合成。IL-17F位點763780所用引物為：F：5′-GGGAATGCAAACAAACACCTGAA-3′，R：5′-CCGTTCCCATCCAGCAAGAGA-3′，所用限制性內(nèi)切酶為：HSP92II(Fermentas, 美國)。IL-17A位點rs2275913所用引物為：F：5′-GCATAACTCTTCTGGCAGCTGTA-3′，R：5′-TGCCCACGGTCCAGAAATAC-3′，所用限制性內(nèi)切酶為：XMNI(Fermentas, 美國)。PCR反應(yīng)體系包括：每管內(nèi)DNA模版1μL、10μmol/L上下游引物各0.2μL、去核酸酶水2μL(Promega，美國)、PreMixTaqDNA聚合酶3μL(Promega，美國)，總體積約6μL。PCR反應(yīng)熱循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性5min，進(jìn)入擴增階段后，變性時間改為30s，IL-17F位點rs763780退火溫度為60℃，IL-17A位點rs2275913退火溫度為58℃，退火時間均為30s；延伸溫度為72℃，時間為30s；此階段循環(huán)36次后，進(jìn)行5min72℃的延伸。PCR反應(yīng)所采用儀器為ABI公司生產(chǎn)的VerityPCR擴增儀。在每5μL擴增出的PCR產(chǎn)物中加入2u限制性內(nèi)切酶，于37℃條件下孵育6h以上。完成酶切后的PCR產(chǎn)物加入3%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠(Biowest，西班牙)，Goldview染色，250V電壓下完成電泳分離后，利用Bio-Rad凝膠成像儀檢測分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。MS患者和正常人的等位基因及基因型頻率先采用χ2檢驗，然后進(jìn)行Bonferroni校正檢驗；臨床癥狀及神經(jīng)系統(tǒng)損傷定位等臨床表型與基因型的相關(guān)性進(jìn)行分析采用Fisher精確概率法；健康對照組的基因頻率分布進(jìn)行哈迪溫伯格平衡檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-17位點同MS的相關(guān)性分析 所有納入的研究對象均分型成功，對照組的基因頻率分布均未偏離哈迪溫伯格平衡，表明樣本來源的人群具有群體代表性。兩組基因及等位基因分型見表1及表2。MS患者組攜帶T等位基因頻率及TT基因型頻率均高于健康對照組(校正后P=0.048，OR=2.102，95% CI=1.224～3.611；校正后P=0.036，OR=2.298, 95%CI=1.278～4.131)。而兩組間IL-17A多態(tài)位點rs2275913的基因型和等位基因頻率的分布并無統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05)。

2.2MS患者臨床表型同IL-17位點的相關(guān)性分析MS組中腦脊液寡克隆帶陽性患者占66.7%(84/126)，周圍運動神經(jīng)癥狀陽性78.6%(99/126)，感覺神經(jīng)癥狀55.6%(70/126)，共濟(jì)失調(diào)55.6%(70/126)，動眼神經(jīng)癥狀8.7%(11/126)，視覺損害19.8%(25/126)，構(gòu)音障礙4.8%(6/126)。MRI檢查結(jié)果所示損傷部位在幕上占94.4%(119/126)，幕下占54.0%(68/126)，腦橋占35.7%(45/126)，小腦占23.0%(29/126)，脊髓占62.7%(79/126)。利用Fisher確切概率法對臨床癥狀與IL-17多態(tài)位點的相關(guān)性，以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷的定位分布與IL-17多態(tài)位點的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各臨床癥狀與IL-17的兩個多態(tài)位點基因型及等位基因頻率無相關(guān)性(P>0.05)，神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位的分布同IL-17位點亦無相關(guān)性(P>0.05)。

表 1 兩組IL-17F 位點rs763780基因型及等位基因的分布

表 2 兩組IL-17A位點rs2275913基因型及等位基因的分布

3 討論

本研究結(jié)果顯示，MS患者中IL-17F的多態(tài)位點rs763780的TT基因型頻率高于健康對照，同時MS患者中rs763780的T等位基因頻率相較健康對照也明顯有增高。而IL-17A多態(tài)位點rs2275913同中國四川漢族人群中MS的發(fā)生則無明顯相關(guān)。以往研究認(rèn)為MS是由Th-1細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)性疾病，但最近的研究結(jié)果表明該疾病的發(fā)生和發(fā)展中有一類新的效應(yīng)T細(xì)胞支系即Th-17細(xì)胞系參與。針對MS患者的脫髓鞘瘢痕的病理研究顯示IL-17陽性細(xì)胞頻率明顯高于健康者。這一現(xiàn)象的原因可能是Th-17細(xì)胞轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，激活并聚集大量非特異性炎性反應(yīng)細(xì)胞，識別并破壞髓鞘抗原，從而導(dǎo)致脫髓鞘改變[6]。同時在MS動物模型中也發(fā)現(xiàn)Th-17細(xì)胞對中性粒細(xì)胞有誘導(dǎo)和聚集作用，并且驅(qū)動未成熟單核細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等迅速增殖并向受損部位遷移，吞噬壞死組織、髓鞘抗原而變?yōu)橥淌杉?xì)胞，最終導(dǎo)致組織損害和脫髓鞘改變[7]。

目前為止，大量證據(jù)表明MS的發(fā)病機制同炎性反應(yīng)細(xì)胞因子以及T細(xì)胞配體如IL-6等基因的多態(tài)性顯著相關(guān)[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)的IL-17家族在多種炎性反應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及外周血單個核細(xì)胞的激活過程以及樹突狀細(xì)胞的熟化過程中起關(guān)鍵作用。IL-17家族共有6種配體蛋白，其中IL-17F及IL-17A均定位于6p12染色體，具有60%以上的核苷酸序列相同[9]。并且在多種炎性反應(yīng)相關(guān)疾病中表現(xiàn)出的蛋白表達(dá)形式也極為相似。

IL-17F位點rs763780為錯義突變，位于IL-17F基因編碼區(qū)第三外顯子，純合子狀態(tài)下可導(dǎo)致組氨酸被精氨酸替換而導(dǎo)致蛋白質(zhì)改變。Kawaguchi等[2]的研究結(jié)果表明該位點同哮喘病相關(guān)，并且證實該位點致氨基酸改變后，IL-17F即不能從分裂素的途徑激活蛋白酶從而影響細(xì)胞因子的表達(dá)。Seiderer等[10]在德國的炎性反應(yīng)性腸病患者中發(fā)現(xiàn)腸局部IL-17F的mRNA水平較健康者高。本研究結(jié)果表明IL-17F多態(tài)位點rs763780的TT基因型同MS呈顯著相關(guān)。這同日本人群中進(jìn)行的該位點和潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘等疾病的相關(guān)性研究的結(jié)果具有相似性[2,4]。同時值得注意的是，本研究結(jié)果同Wang等[3]進(jìn)行的IL-17F在中國南方人群中視神經(jīng)髓鞘炎發(fā)病相關(guān)性的研究結(jié)果一致，此結(jié)果進(jìn)一步提示rs763780可能與IL-17神經(jīng)脫髓鞘作用相關(guān)。然而該位點的T等位基因作為易感基因型在基因座中占多數(shù)，在健康者中也有攜帶卻并未導(dǎo)致正常人發(fā)生MS，由此表明：(1) MS作為一類復(fù)雜的遺傳疾病，其遺傳模式為多基因共同作用，單一基因在遺傳異質(zhì)性不同的個體上的表達(dá)并不統(tǒng)一，因此IL-17F位點同MS的相關(guān)性雖可能是其發(fā)病的重要因素之一，但并不能完全解釋MS的發(fā)病機制[1]。(2) IL-17F所觸發(fā)的眾多下游炎性反應(yīng)因子在不同個體以及全身不同位置的表達(dá)強度及持續(xù)時間有較大差異[2]。

本研究并未發(fā)現(xiàn)IL-17A位點rs2275913同中國四川漢族人群MS發(fā)病相關(guān)。Ramsey等[11]對歐洲哮喘患者進(jìn)行了IL-17A的多態(tài)掃描，并未發(fā)現(xiàn)IL-17A同歐洲哮喘患者相關(guān)。Shibata等[12]對日本的皮炎患者的研究中也并沒有發(fā)現(xiàn)IL-17A多態(tài)位點同該病的相關(guān)性。Shu等[13]曾嘗試探討IL-17A位點是否同中國漢族Behcet’s病患者相關(guān)，結(jié)果也表明該位點并未顯著影響該疾病的發(fā)生。這些結(jié)果表明，即使是同類疾病，在不同種族之間，IL-17通路在發(fā)病機制中所起的作用也截然不同。本研究中IL-17A多態(tài)位點rs2275913同中國四川漢族人群MS發(fā)病并沒有顯著相關(guān)，原因可能為：(1)盡管rs2275913位于IL-17A基因上游，可能接近或位于啟動子區(qū)，而并未引起氨基酸改變，因此未能影響IL-17A表達(dá)的水平。(2)rs2275913可能與其他有功能的、未知的多態(tài)位點有連鎖關(guān)系，而并不作為一個獨立因素參與MS的發(fā)病。(3)各研究的樣本量大小不同，因此可能需要進(jìn)一步驗證本位點的確切作用。

通過Fisher確切概率法對IL-17的兩個多態(tài)位點的基因型及等位基因頻率同MS患者臨床癥狀如共濟(jì)失調(diào)、視力損害和構(gòu)音障礙等臨床特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IL-17位點并未同MS患者的臨床表型相關(guān)。根據(jù)MRI掃描結(jié)果記錄所示的患者神經(jīng)系統(tǒng)損傷位置的分布探討其損傷分布頻率是否同IL-17多態(tài)位點相關(guān)。分析結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)MS患者神經(jīng)損傷的定位分布同IL-17位點有顯著相關(guān)。提示IL-17多態(tài)位點與MS的發(fā)生相關(guān)，但是同臨床癥狀的出現(xiàn)沒有明確的相關(guān)性。

在MS的發(fā)病機制中，遺傳易感性是極為重要的一環(huán)，遺傳易感性也是該類自身免疫病研究的熱點問題。本研究發(fā)現(xiàn)IL-17F多態(tài)位點rs763780的TT基因型及T等位基因在中國四川漢族MS患者中明顯高于對照組，其多態(tài)位點rs763780基因型TT及T等位基因與中國四川漢族人群中MS的發(fā)病有顯著相關(guān)，表明IL-17F可能是MS的易感基因。IL-17A多態(tài)位點rs2275913則與中國四川漢族人群MS發(fā)病無明顯相關(guān)。

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(本文編輯：時秋寬)

Association of interleukin-17F and interleukin-17A gene polymorphisms with multiple sclerosis in a Sichuan Han population

FUHongmei,WANGYinxu,WANGXiaoming*,LUOJiamin.

*Department of Neurology, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong Sichuan 637000, China

WANGXiaoming,Email:shakins@163.com

ObjectiveTodiscussthegeneticassociationofinterleukin(IL)-17polymorphismswithmultiplesclerosis(MS)inSichuanHanpopulation.MethodsTwosinglenucleotidepolymorphisms(SNPs),rs763780ofIL-17Fgeneandrs2275913ofIL-17Ageneweregenotypedin126MSpatientsand176healthycontrolsbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphismmethod(PCR-RFLP).Allcontrolsubjectsandpatientswereethnicallyandgeographicallymatched.AlleleandgenotypefrequenciesdistributionsbetweenpatientsandcontrolswerecomparedusingtheChi-Squaretest.ResultsAsignificantlyincreasedrs763780TTgenotypefrequency(correctedP=0.036)andTallelefrequency(correctedP=0.048)werefoundinMSpatientsincomparisonwithcontrols.Thegenotypicandallelicfrequenciesofrs2275913inIL-17AgenewerenotdifferentbetweenpatientswithMSandcontrols.ConclusionsTheseresultssuggestthatrs763780isassociatedwithmultiplesclerosisinaSichuanHanpopulation,TTgenotypeandTalleleofrs763780mayconferhigherriskofMS,whereasrs2275913inIL-17AgeneisnotassociatedwithMS.

multiplesclerosis;interleukin-17;polymorphism,singlenucleotide

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.004

南充市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)資金資助項目(南充科技局13A0031)

637000 川北醫(yī)學(xué)院(付紅梅、羅家明)；637000 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王寅旭、王曉明)

王曉明，Email：shakins@163.com

R744.5+1

A

1006-2963 (2015)01-0012-04

2014-04-19)