免疫比濁法與離子交換層析微柱法測定糖化血紅蛋白的方法學(xué)比較

楊 軍

(四川省自貢市第四人民醫(yī)院檢驗科，四川 自貢 643000)

免疫比濁法與離子交換層析微柱法測定糖化血紅蛋白的方法學(xué)比較

楊 軍

(四川省自貢市第四人民醫(yī)院檢驗科，四川 自貢 643000)

目的 對免疫比濁法與離子交換層析微柱法定量檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)進行方法學(xué)比較。方法 采用免疫比濁法和離子交換層析微柱分別對同一標(biāo)本做HbA1c含量檢測，比較兩種方法的精密度、準(zhǔn)確性、線形范圍、相關(guān)性和單位樣本測定時間。結(jié)果 免疫比濁法精密度和重復(fù)性較好，與離子交換層析微柱法差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)；免疫比濁法和離子交換層析微柱法具有較高相關(guān)性(r=0.9540，P< 0.01)。測得正常組、糖尿病A組、糖尿病B組的HbA1c值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。結(jié)論 兩種方法測定HbA1c均具有較高的精確度和重復(fù)性，但免疫比濁法操作更簡單，要求標(biāo)本量少，可作為自動化檢測HbA1c的首選方法。

糖化血紅蛋白；免疫比濁法；離子交換層析微柱

糖尿病的檢測指標(biāo)有血糖測定、尿糖測定、OGTT等，而糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)作為糖尿病長期監(jiān)測指標(biāo)日益受到重視[1]。HbA1c是由血紅蛋白(hemoglobin，Hb)β鏈氨基末端頡氨酸殘基與葡萄糖醛基非酶促反應(yīng)縮合而成，糖尿病時可占Hb總量的8%～30%。其糖鏈結(jié)構(gòu)為α2(β-G)2，半衰期為60天，其形成取決于血糖濃度和作用時間，與血液中葡萄糖濃度成正比，可反映患者近2～3月血糖水平。故HbA1c檢測對糖尿病的診斷和治療有重要價值。離子交換層析微柱法為目前檢測HbA1c的主要方法，但其方法比較煩瑣、費時，而且成本比較高。本研究采用免疫比濁法檢測HbA1c，并與離子交換層析微柱法比較。

1 對象與方法

1.1 檢測對象 經(jīng)臨床確診的本院門診和住院糖尿病患者50例(糖尿病組)，均符合1985年WTO的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男26例，女24例，年齡(48±14.3)歲，空腹血糖6.8～12.0 mmol/L者33例(A組)，>12.0 mmol/L者17例(Β組)。同期健康體檢者(正常組)50例，排除糖尿病、肝病和其他內(nèi)分泌疾病，男27例，女23例，年齡(34.53±7.49)歲。

1.2 儀器與材料 HbA1c免疫比濁法試劑盒為Tina-quant，HbA1c(Roche，批號為1822039)，試劑成分為HbA1c抗體、HbA1c多聚半抗原及緩沖液等。標(biāo)準(zhǔn)品由Roche提供。微柱法測定試劑(Biosystem提供)主要成分為低離子強度弱酸性陽離子交換樹脂微柱，洗脫液(洗脫液A：磷酸鹽緩沖液pH 7.0；洗脫液B：磷酸鹽緩沖液pH6.7)以及溶血素組成。主要儀器有Biosystem BTS 330分光光度計，全自動生化分析儀OLYMPAS 2700。

1.3 方法 ①免疫比濁法：取溶血劑于室溫放置幾分鐘。毛細(xì)血管血20 μl和2.0 ml溶血劑或肝素(EDTA)抗凝血10 μl和溶血劑1.0 ml，輕搖混勻1～2分鐘后待混合物變?yōu)闇\褐色可用。取溶血標(biāo)本0.5 ml上機操作。HbA1c%=(HbA1c含量/總Hb含量)×100%。②離子交換層析微柱法：所有試劑及標(biāo)本于室溫放置10分鐘。取EDTA抗凝血50 μl和溶血劑200 μl充分混勻制成Hb溶液，將此溶液50 μl加入預(yù)先沉淀好的微柱中，200 μl洗脫液A預(yù)洗，再加洗脫液A 2.0 ml洗脫。最后用洗脫液B 4.0 ml收集并以去離子水調(diào)零在415 nm處測定吸光度值A(chǔ)HbA1c。取溶血樣品10 μl加上洗脫液B 2.4 ml，混勻，去離子水調(diào)零在415 nm處測定吸光度值A(chǔ)HbTOTAL。HbA1c%=AHbA1c/(3×AHbTOTAL)×100%

2 結(jié)果

2.1 HbA1c測定結(jié)果 如表1所示，兩種方法均顯示糖尿病A、B組HbA1c明顯高于正常組(P< 0.05)，但A、B組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。

表1 3組HbA1c測定結(jié)果 (%)

﹡與正常組比較，P< 0.05

2.2 線性范圍 取已知濃度的標(biāo)本作等比稀釋并作相關(guān)分析，HbA1c的檢測范圍：免疫比濁法為6～20 g/L，離子交換層析微柱法為8～24 g/L，Hb的檢測范圍前者為60～200 g/L，后者為50～180 g/L。當(dāng)Hb含量正常時HbA1c的線形范圍是前者2%～20%，后者3%～18%。

2.3 精密度 正常人和糖尿病患者抗凝血各一份，HbA1c分別為(5.98±0.09)%、(9.40±0.11)%，分別重復(fù)測定20次，批內(nèi)CV值：免疫比濁法為1.40%和1.15%，離子交換層析微柱法為1.5%和1.3%。兩份EDTA抗凝血，HbA1c分別是(5.04±0.12)%和(8.62±0.15)%，各分裝20份4 ℃保存，每天測各一次，連續(xù)測定10天，結(jié)果日間CV值：免疫比濁法為2.82%和2.57%，離子交換層析微柱法為2.97%和2.74%。免疫比濁法符合精確實驗方法標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 準(zhǔn)確性 HbA1c分別為4.8%、6.9%、10.7%的三份低、中、高標(biāo)本中加入HbA1c標(biāo)準(zhǔn)品0.83 g/dl和2.54 g/dl重復(fù)測定三次：免疫比濁法、離子交換層析微柱法的平均回收率分別是100.4%和100.9%。

2.5 方法學(xué)比較 對結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，得出回歸方程。免疫比濁法與離子交換層析微柱法得出的結(jié)果一致。經(jīng)過相關(guān)處理，其相關(guān)系數(shù)r=0.9540，P< 0.01，回歸方程為Y=0.9405X+0.0205。

2.6 單位樣品測試時間 準(zhǔn)備時間：免疫比濁法與離子交換層析微柱法分別要1～2 min和15～20 min；實驗時間：各需要10 min和165～215 min。

3 討論

HbA1c作為糖代謝的長期監(jiān)測指標(biāo)重要性毋庸質(zhì)疑，測定方法有多種如離子交換樹脂微柱層析法、高壓液相法、瓊脂凝膠電泳法、等電點聚集法、親和色譜微柱法、放射免疫法、離子捕獲法、等電聚焦與毛細(xì)電泳系統(tǒng)、TBA比色法、電泳質(zhì)譜測定法(ESMS)、不連續(xù)親和電泳法等，不同的方法測定的HbA1c值不盡相同，可比性較差[2]。HbA1為HbA1a、HbA1b、HbA1c等亞單位的混合物，HbA1c為主要成分。測定過程中存在眾多干擾因素(FHb、HbE、HbH、HbS、遺傳變異Hb及其降解產(chǎn)物)。隨著生活條件的改善，糖尿病的發(fā)病率在逐年上升，對于糖尿病的診斷和治療及療效觀察，建立一種處理標(biāo)本簡便、速度更快、重復(fù)性好、尤其是特異性高、干擾因素少從而滿足臨床需要的方法勢在必行。

免疫比濁法是應(yīng)用小鼠單克隆抗Hbβ鏈糖化氨基末端的特異性抗體與標(biāo)本中的HbA1c作用形成抗原-抗體復(fù)合物，再通過多聚半抗原與剩余的抗Hb抗體結(jié)合形成一種較穩(wěn)定的多聚半抗原-抗體復(fù)合物，在531nm波長測定時吸收增加，形成濁度。反應(yīng)液濁度的變化與標(biāo)本中的HbA1c的濃度成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測得HbA1c的值。另采用氰化高鐵法測定標(biāo)本中Hb總量，并計算HbA1c占Hb的百分比。離子交換層析微柱法是利用帶有負(fù)電荷的低離子強度弱酸性陽離子交換樹脂與帶正電荷的Hb及HbA1c有親和力，但由于HbA1c的兩個β鏈N末端被糖基清除，正電荷較Hb少，兩者對樹脂的親和力不同。用磷酸緩沖液過柱，最后用高離子強度分離試劑分離HbA1c，在415 nm波長測定，并計算HbA1c占Hb的百分比。

兩種方法的批間CV值和批內(nèi)CV值均小于1.5%和5%，已經(jīng)達(dá)到美國國立醫(yī)院建立的HbA1c的檢測標(biāo)準(zhǔn)[3]，可以作為糖尿病患者的檢測手段。離子交換層析微柱法作為臨床上常用的方法，無需要貴重儀器設(shè)備，可以被大多數(shù)臨床實驗室接受且與參比方法相關(guān)性較好。但是操作完全依賴手工，費時費力，檢測易受HbF、HbS的影響[4]，且檢測時受到溫度的影響較大，每次測定都需要作標(biāo)準(zhǔn)對照管。免疫比濁法適用于自動化分析、速度快、標(biāo)本處理簡單、適應(yīng)臨床上越來越多的標(biāo)本的需要，與參比方法HPLC具有高度相關(guān)性[5]。

免疫比濁法與離子交換層析微柱法平行測定發(fā)現(xiàn)本組實驗免疫比濁法測定值偏低，正常對照組免疫比濁法與離子交換層析微柱法分別是(4.87±0.37)%和(5.32±0.41)%；糖尿病A組是(9.23±0.41)%和(9.23±0.41)%；B組是(11.02±0.43)%和(11.15±0.47)%。除去方法學(xué)上的差異外，重要的原因是免疫比濁法是應(yīng)用抗Hbβ鏈糖化氨基末端的特異性抗體與標(biāo)本中的HbA1c作用形成抗原-抗體復(fù)合物，再通過多聚半抗原與剩余的抗Hb抗體結(jié)合形成一種較穩(wěn)定的多聚半抗原-抗體復(fù)合物，形成濁度。因此對于N末端的順序特異性要求更高。且研究表明其不受HbA2、HbS、HbF、遺傳Hb、HbE、HbH和HbC的影響[6～8]。

免疫比濁法的標(biāo)本可以采用毛細(xì)血管采血，簡單快捷，采血量少，可隨機采血進行單個樣本的測定，研究表明毛細(xì)血管血和靜脈血HbA1c，其結(jié)果無差異[9]。因而極大地方便了醫(yī)生和患者，可以使患者免于靜脈穿刺的困難和痛苦，更適用于門診和急診的需要，方便老年和幼兒患者，對于正在輸注葡萄糖液體以及各種昏迷休克等危重患者、妊娠糖尿病患者提供快捷準(zhǔn)確的實驗證據(jù)。

兩種方法的單位標(biāo)本時間的比較顯示：免疫比濁法的標(biāo)本預(yù)處理簡便而時間短。實驗的平均時間更是只有離子交換層析微柱法的10%，速度更快，效率更高，在臨床標(biāo)本日益增多的今天，前者無疑更具優(yōu)勢。因此采用免疫比濁法測定HbA1c，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、穩(wěn)定性強、不易受到干擾物質(zhì)的影響，標(biāo)本處理簡單快捷、可以使用毛細(xì)血管取血、適合自動化分析，是適合目前臨床需要的首選方法。

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R446.6

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1672-6170(2015)01-0100-03

2014-06-20；

2014-08-10)