單糖柱前PMP衍生HPLC測定方法探討

朱照武，莊 洋，向春林，趙 娜，李 珊，向玲芳，莫開菊?

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族學(xué)院），湖北 恩施 445000）

單糖柱前PMP衍生HPLC測定方法探討

朱照武1，2，莊 洋1，2，向春林1，2，趙 娜2，李 珊1，2，向玲芳1，2，莫開菊1，2?

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族學(xué)院），湖北 恩施 445000）

從PMP萃取酸度、萃取次數(shù)探討了柱前PMP衍生方法對單糖－PMP衍生物的影響，并從流動相比例、緩沖液pH值、緩沖鹽濃度三個方面對單糖柱前衍生HPLC的分離效果進(jìn)行了優(yōu)化研究.結(jié)果表明：單糖進(jìn)行PMP衍生后，用HCl中和至pH為7.0，能最大限度避免單糖－PMP衍生產(chǎn)物的損失；使用三氯甲烷萃取PMP三次時，能在除去PMP的情況下避免單糖－PMP衍生產(chǎn)物的損失；降低流動相中有機(jī)相的比例或提高緩沖液的pH值，有利于色譜峰分離度的提高；提高緩沖鹽濃度，有利于保持色譜峰的對稱性.

單糖；PMP衍生物；高效液相色譜；分離度；不對稱因子

多糖類物質(zhì)廣泛存在于自然界中，近年來，我國對植物多糖展開了廣泛的研究，植物多糖的藥理活性是研究的重點(diǎn)［1－4］.多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的，多糖的單糖組成作為一級結(jié)構(gòu)的主要內(nèi)容，自然成為研究多糖生物活性的基礎(chǔ)［5］.糖類物質(zhì)因不具有發(fā)色基團(tuán)不能直接使用紫外和熒光檢測而限制了分析手段的應(yīng)用，自1989年Honda等［6－8］首次在弱堿性條件下成功實(shí)現(xiàn)PMP糖類衍生，使糖類被標(biāo)記上紫外吸收基團(tuán)，具有強(qiáng)烈的紫外吸收，糖類的分析方法就得到快速發(fā)展.其中，PMP柱前衍生化HPLC分析成為糖類分析的重要方法.楊興斌等［9］建立了當(dāng)歸多糖單糖組成的PMP柱前衍生化HPLC方法，Lv等［10］利用PMP柱前衍生化HPLC法分析出綠茶多糖由甘露糖、木糖、阿拉伯糖等9種單糖組成.

盡管PMP在糖類檢測方面具有優(yōu)越性，但是糖類－PMP衍生方法仍存在一定不足.有報道指出，PMP衍生產(chǎn)物易丟失1分子PMP，且PMP試劑的疏水性偏低，多次萃取難以完全去除，萃取過程也會引起部分樣品的損失［11］.Castells［12］也報道過PMP萃取過程會導(dǎo)致衍生產(chǎn)物的損失.此外，戴軍［13］對三氯甲烷萃取時溶液的酸度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溶液偏堿性時衍生產(chǎn)物在三氯甲烷中有一定的溶解度，會造成損失，這與Strydom［14］的研究結(jié)果一致；若萃取時溶液偏酸性，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，也會造成結(jié)果偏低.

單糖種類繁多，許多植物多糖的單糖組成復(fù)雜，經(jīng)常需要調(diào)整液相色譜條件使各種單糖衍生物的色譜峰達(dá)到完全分離.在色譜柱固定的條件下，色譜峰的分離效果很大程度取決于流動相，因此，了解流動相對色譜峰分離效果及峰形的影響有利于在不同條件下獲得良好的單糖衍生物色譜圖.

本文從單糖的PMP衍生方法及衍生產(chǎn)物的HPLC分離兩個方面進(jìn)行探討，為單糖柱前PMP衍生HPLC方法的優(yōu)化提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D－甘露糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖 德國Dr.Ehrenstorfer公司；D－葡萄糖、L－巖藻糖 美國sigma公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、D－葡萄糖醛酸、D－半乳糖醛酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈 色譜純 美國TEDIA天地試劑公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷均為國產(chǎn)分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

P680 ALPG高效液相色譜儀，包括DAD－100檢測器、TCC－100柱溫箱和Chromeleon色譜工作站（戴安中國有限公司）；MS1 Minishaker漩渦混合器（德國IKA公司）；GZX－9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）.

1.3 方法

1.3.1 單糖的衍生 分別配制一定濃度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及巖藻糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取50 μL置于5 mL的具塞試管中，各加50 μL 0.6mol／L的NaOH溶液，漩渦混勻；再加100μL0.5mol／L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，在70℃的烘箱中避光反應(yīng)100min，取出避光放置10min冷卻至室溫，加一定量的0.3 mol／L的HCL，加水至2 mL，再加2 mL的三氯甲烷，漩渦混勻，靜置，棄去三氯甲烷相，如此萃取幾次.將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)行分析.

1.3.2 高效液相色譜分析 色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A液：0.1mol／L的pH6.7磷酸鉀鹽緩沖液，B液：乙腈；柱溫：30℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL／min；進(jìn)樣體積：20μL.

1.3.3 萃取酸度對PMP衍生產(chǎn)物的影響 衍生反應(yīng)結(jié)束后，待混合標(biāo)準(zhǔn)液冷卻至室溫，分別加入80、90、100、110、120μL 0.3mol／L的鹽酸，加水至2mL，同1.3.1法萃取、過0.45μm微孔膜后進(jìn)行HPLC分析.

1.3.4 萃取過程對PMP殘留及衍生產(chǎn)物的影響 樣品按1.3.1衍生中和后，加入三氯甲烷，漩渦混勻10s間隔5s，重復(fù)3次后，靜置，棄去三氯甲烷層，如此分別萃取1、2、3、4、5次.樣品過0.45μm微孔膜后進(jìn)行HPLC分析.

1.3.5 流動相比例對單糖衍生物的分離度影響 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液進(jìn)行PMP衍生后，分別在流動相比例為A液∶B液＝80∶20、81∶19、82∶18、83∶17的條件下進(jìn)行HPLC分析，比較色譜峰的分離度R．

1.3.6 流動相pH值對單糖衍生物的分離度影響 分別配制pH為6.5和6.7的0.1 mol／L的磷酸鉀鹽緩沖液為A液，以最佳流動相比例對單糖衍生物進(jìn)行HPLC分析，比較色譜峰的分離度R．

1.3.7 磷酸緩沖鹽濃度對色譜峰對稱性的影響 分別配制濃度為0.01、0.05、0.1mol／L pH6.7的磷酸鉀鹽緩沖液作為流動相A液，在最佳流動相比例下，對葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖四種單糖衍生物進(jìn)行HPLC分析，比較色譜峰的不對稱因子As．

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取酸度對PMP衍生產(chǎn)物的影響

PMP衍生結(jié)束后，加入HCl中和，在中性條件下，利用三氯甲烷萃取出多余的PMP，保留單糖－PMP衍生產(chǎn)物.萃取時溶液環(huán)境偏酸或偏堿均會對單糖－PMP衍生產(chǎn)物造成影響，如表1，若溶液偏堿性，則單糖－PMP衍生物的峰面積低于完全中和時的測定結(jié)果，若中和過度，溶液偏酸性，單糖－PMP衍生物的峰面積也低于完全中和時的測定結(jié)果.總之，萃取時溶液偏酸或偏堿均會影響試驗(yàn)結(jié)果，這與戴軍［13］的研究一致.

試驗(yàn)結(jié)果表明，萃取酸度對不同單糖衍生物的影響不同，對葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的PMP衍生產(chǎn)物的影響最大，對甘露糖和鼠李糖的PMP衍生物的影響最小.溶液呈中性時，八種單糖－PMP衍生物峰面積的總和最大.

2.2 萃取過程對PMP殘留的影響萃取時，若PMP萃取不徹底，HPLC圖譜中PMP峰明顯，影響圖譜效果；若PMP萃取過度，可能會造成單糖－PMP衍生產(chǎn)物的損失.分別對混合標(biāo)準(zhǔn)品的衍生液萃取1、2、3、4、5次后的結(jié)果如圖

1和表2.

圖1 三氯甲烷萃取次數(shù)對PMP的影響Fig.1 Effects of chloroform extrction times on PMP

表1 中和對萃取過程中單糖－PMP衍生物的影響Tab.1 Effects of neutralization before extraction on derivatives

三氯甲烷萃取一次時，溶液中單糖－PMP衍生產(chǎn)物的峰面積最大，但PMP殘留嚴(yán)重，峰面積大于單糖－PMP衍生產(chǎn)物，當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)到3次時，PMP殘留量較低，不影響圖譜效果，萃取4次時圖譜上已無明顯PMP峰.

但隨著萃取次數(shù)的增加，單糖－PMP衍生物的含量卻逐步降低，萃取5次時，單糖－PMP衍生物的含量出現(xiàn)明顯下降.因此，綜合考慮單糖－PMP衍生物的保留、PMP的去除以及萃取工作量，選擇萃取3次較合適.

2.3 流動相比例對單糖衍生物分離度的影響

在實(shí)驗(yàn)條件下，8種單糖衍生物的保留順序依次為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖.四種流動相比例條件下，8種單糖衍生物的色譜峰分離效果如圖2.

表2 三氯甲烷萃取次數(shù)對單糖－PMP衍生物的影響Tab.2 Effects of chloroform extrction times on derivatives

圖2 流動相比例對色譜峰分離度的影響Fig.2 Effects of moblie phase ratio on seperation of peaks

由圖2看出，pH6.7的緩沖液∶乙腈＝80∶20時，鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的色譜峰完全重疊，且與半乳糖醛酸衍生物不能完全分離；隨著緩沖液比例的提高，鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸衍生物色譜峰的分離度逐漸提高，當(dāng)緩沖液比例提高到82%時，8種單糖衍生物達(dá)到完全分離；繼續(xù)提高緩沖液比例至83%時，分離效果進(jìn)一步改善.4種流動相比例下，各單糖衍生物色譜峰的分離度R如表3，提高緩沖液比例降低有機(jī)相比例時，色譜峰的分離度R提高，但保留時間延長，流動相比例為83∶17時，樣品運(yùn)行時間長達(dá)50 min.因此，選擇剛好能使八種單糖衍生物完全分離的流動相比例，即pH6.7磷酸緩沖液 ∶乙腈＝82∶18.

2.4 緩沖液pH值對單糖衍生物分離度的影響

色譜柱使用一段時間后，柱效降低，流動相比例為pH6.7的磷酸緩沖液 ∶乙腈＝82∶18時，鼠李糖與半乳糖醛酸的分離度R下降，不能完全分離.在保持流動相比例不變的條件下，降低緩沖液pH，八種單糖衍生物的分離效果如圖3.

表3 流動相比例對色譜峰分離度R的影響Tab.3 Effects of moblie phase ratio on seperation of peaks

圖3 緩沖液pH值對色譜峰分離度的影響Fig.3 Effects of pH on seperation of peaks

在本試驗(yàn)條件下，將磷酸緩沖液的pH從6.7降低到6.5，能顯著改善鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的分離效果，達(dá)到完全分離，但同時樣品分離時間延長.兩種pH條件下，八種單糖衍生物的分離度R如表4，pH6.5條件下各色譜峰的分離度R幾乎均大于pH6.7.因此，降低磷酸緩沖液的pH，有助于提高色譜峰的分離效果.

2.5 緩沖鹽濃度對色譜峰的影響

分別使用鹽濃度為0.01、0.05、0.10mol／L的pH6.7磷酸鉀鹽緩沖液作為流動相A液，對葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖四種單糖衍生物進(jìn)行HPLC分析，比較不同緩沖鹽濃度對色譜峰不對稱因As的影響．結(jié)果如圖4和表5，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，緩沖鹽濃度越高，不對稱因子As越小，峰形越好.當(dāng)鹽濃度為0.01 mol／L時，色譜峰的不對稱因子As均高于1．4，明顯拖尾；當(dāng)鹽濃度為0.05mol／L時，色譜峰的不對稱因子As有所降低，色譜峰對稱性提高；當(dāng)鹽濃度為0.10mol／L時，色譜峰的不對稱因子As在1．05～1．2之間，對稱性較好．

表4 緩沖液pH值對色譜峰分離度的影響Tab.4 Effects of pH on seperation of peaks

圖4 不同緩沖鹽濃度下的色譜峰圖譜Fig.4 Effect of buffer concentration on asymmetry factor of peaks

3 結(jié)論與討論

本文研究了單糖衍生方法的中和、萃取過程對單糖－PMP衍生物的影響以及流動相對HPLC色譜峰的影響，結(jié)果表明：

1）衍生結(jié)束后使用HCl完全中和，可以避免單糖－PMP衍生產(chǎn)物的損失.

可能是由于單糖－PMP衍生物含有堿性基團(tuán)，易在堿性條件下隨三氯甲烷萃取損失，而在酸性的環(huán)境中不穩(wěn)定，其原因需進(jìn)一步研究確認(rèn).

2）使用三氯甲烷萃取PMP時，萃取多次可以顯著降低PMP的殘留，但在中性條件下萃取，仍然會造成單糖－PMP衍生產(chǎn)物的損失.選擇萃取3次，能較好平衡PMP去除和衍生產(chǎn)物保留的關(guān)系.

3）降低流動相中有機(jī)相的比例或降低緩沖液的pH值，均能提高單糖衍生物色譜峰的分離效果；提高緩沖鹽濃度，能改善色譜峰的峰形，防止拖尾.

使用磷酸緩沖液作為無機(jī)相時，為保持峰形對稱，需要較高的鹽濃度，而高濃度的鹽溶液對液相色譜系統(tǒng)和色譜柱均不利，有研究表明使用低濃度的乙酸銨鹽溶液也能得到對稱性好的色譜峰［15－17］，因此，應(yīng)考慮使用乙酸銨鹽或?qū)ふ移渌木彌_體系替代磷酸緩沖鹽.實(shí)驗(yàn)中樣品不同濃度會影響色譜圖響應(yīng)值.

表5 不同緩沖鹽濃度下的色譜峰不對稱因子AsTab.5 Effects of buffer concentration on asymmetry factor of peaks

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責(zé)任編輯：高 山

Research on the Method of PMP Pre－column Derivation of Monosaccharides by HPLC

ZHU Zhaowu1，2，ZHUANG Yang1，2，XIANG Chunlin1，2，ZHAO Na2，LI Shan1，2，XIANG Lingfang1，2，MO Kaiju1，2?
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Key Laboratory of Biologic Resources and Utilization of Hubei Province（Hubei University for Nationalities），Enshi 445000，China）

This article discussed the impact of PMP pre－column derivation on monosaccharide derivatives from extraction pH and extraction times.Moreover，the influence of mobile phase on the HPLC chromato?graphic peaks also have been studied from the ratio of mobile phase，the pH of buffer and the concentra?tion of buffer.The results indicated：Neutralized the derivation liquid with HCl to pH7.0 could avoid the loss of derivatives products to the utmost.Extracting three times by chloroform could remove almost PMP and avoid the loss of derivatives.Reducing the ratio of organic phase or the pH of buffer could improve the seperation of peaks；the asymmetry factor of peaks could be maintained in the optimum range by increas?ing the concentration of buffer.

monosaccharides；PMP derivatives；HPLC；seperation；asymmetry factor

O657.72

A

1008－8423（2015）03－0337－05

10.13501／j.cnki.42－1569／n.2015.09.027

2015－05－19.

湖北省研究與開發(fā)計劃項目（2010BBB016）.

朱照武（1989－），女，碩士生，主要從事林特食品加工與開發(fā)研究；?

莫開菊（1965－），女，博士，教授，主要從事食品加工及天然產(chǎn)物化學(xué)的研究.