RP-HPLC同時測定復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量

高磊 賈燕花 王曉青 劉皈陽

·藥物研究·

RP-HPLC同時測定復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量

高磊 賈燕花 王曉青 劉皈陽

目的建立同時測定復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定含量的反相高效液相色譜方法(RP-HPLc)。方法采用高效液相色譜法，C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相以甲醇為流動相A，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 3.5)(20∶80)為流動相B，采用梯度洗脫方法;檢測波長為280 nm。結(jié)果替硝唑和醋酸氯己定的含量分別在80.2～280.7 μg/ml、80.28～280.98 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為100.08%和100.33%(n=6)。結(jié)論該方法操作簡便，結(jié)果可靠，可以用于同時測定復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量，以控制該制劑的質(zhì)量。

替硝唑;醋酸氯己定;高效液相色譜法;含量測定

復(fù)方替硝唑溶液臨床上用于口腔厭氧菌感染及其他細(xì)菌感染引起的咽峽炎、牙周炎及口腔潰瘍等，主要成分為替硝唑和醋酸氯己定等。該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅采用紫外分光光度法控制替硝唑的含量，未進(jìn)行醋酸氯己定的含量控制。因此，參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-12］，在保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和良好的檢測效率的前提下，筆者通過摸索實(shí)驗(yàn)條件，建立了同時定量檢測復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的反相高效液相色譜法(RP-HPLc)，以便提供安全、有效的藥品。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀(1100，Agilent)，色譜柱(C18，Thermo Scientific)，pH計(jì)(pHS-3E，上海雷磁)，紫外分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津)，電子天平(BT25S，賽多利斯)。

1.2 試藥替硝唑(100336-200703，中國食品藥品檢定研究院)，醋酸氯己定(100183-201003，中國食品藥品檢定研究院)，復(fù)方替硝唑溶液(20130724，130806A，第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院;130814，中國人民解放軍總醫(yī)院第175醫(yī)院;1307371，上海長海醫(yī)院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇為流動相A，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH值3.5)(20∶80)為流動相B，流速為每分鐘1 ml，照下表進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長280 nm;進(jìn)樣量為10 μl。

時間(min)流動相A(%)流動相B(%) 100 8 5545 155546 15.10100 0 0 200100

2.2 對照品溶液的配制替硝唑?qū)φ掌啡芤旱呐渲?精密稱取替硝唑?qū)φ掌愤m量，置于量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1毫升中約含替硝唑0.2 mg的溶液，作為替硝唑?qū)φ掌啡芤?醋酸氯己定對照品溶液的配制:精密稱取醋酸氯己定對照品質(zhì)量，置于量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1毫升中約含醋酸氯己定0.2 mg的溶液，作為醋酸氯己定對照品溶液;混合對照品溶液制備:分別精密稱取替硝唑?qū)φ掌泛痛姿崧燃憾▽φ掌犯鬟m量，置于同一容量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1毫升中約含替硝唑0.2 mg、醋酸氯己定0.2 mg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制取供試品適量，濾過，即得。

2.4 陰性樣品溶液的配制按照處方比例，精密稱取20 mg甜葉菊苷置于50 ml量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，精密量取替硝唑?qū)φ掌啡芤?、醋酸氯己定對照品溶液、陰性樣品溶液?0 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。主成分甲硝唑、酮康唑和丙酸氯倍他索的色譜峰分離度良好。見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察精密稱取替硝唑?qū)φ掌?0 mg，醋酸氯己定對照品20 mg，置同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性儲備液;分別精密量取2、3、4、5、6、7 ml置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為線性供試液。精密量取上述供試液10 μl進(jìn)樣，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別以替硝唑和醋酸氯己定濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程。替硝唑:Y=7.16X+7.38，r= 0.9995;醋酸氯己定:Y=12.37X-9.23，r=0.9995。結(jié)果表明，替硝唑和醋酸氯己定分別在80～280 μg/ml、80～280 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合規(guī)定。

圖1 替硝唑?qū)φ掌?A)、供試品溶液(B)、醋酸氯己定對照品(C)、陰性樣品(D)色譜圖

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)精密量取混合對照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算替硝唑和醋酸氯己定的吸收峰面積RSD值，分別為0.13%和0.04%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密量取供試品溶液，在相同色譜條件下分別于0、6、12、24、48 h精密量取10 μl，記錄峰面積，計(jì)算替硝唑和醋酸氯己定的吸收峰面積RSD值，分別為0.06%和0.12%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取批號為130814的復(fù)方替硝唑，按照“2.3”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下的色譜方法平行測定，替硝唑和醋酸氯己定含量的RSD值分別為0.09%和0.53%(n=6)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)分別精密稱取替硝唑?qū)φ掌愤m量(相當(dāng)于替硝唑16 mg、20 mg、24 mg，相當(dāng)于醋酸氯己定16 mg、20 mg、24 mg)，置于100 ml量瓶中，按照處方比例加入輔料，加水溶液并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為80%、100%、120%的供試品溶液，每種濃度制備3份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算各水平的回收率。替硝唑的平均回收率為100.08%，RSD值為0.79%;醋酸氯己定的平均回收率為100.33%，RSD值為1.07%。

2.11 樣品測定按照上述色譜條件，分別精密量取供試品溶液和對照品溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品的含量。見表2。

表1 樣品含量測定結(jié)果%

3 討論

替硝唑在317 nm處有較強(qiáng)吸收;醋酸氯己定在255 nm處有較強(qiáng)吸收;空白輔料在280 nm處無吸收。故選擇280 nm作為本品的檢測波長。

供試品經(jīng)濾過后直接進(jìn)樣，響應(yīng)值符合高效液相色譜法含量測定的要求，該供試品制備方法簡便，易于常規(guī)操作。同時，由于該制劑主要溶劑為水，因此首選水作為對照品溶液制備的溶劑，并獲得良好的峰形。

《中華人民共和國藥典》2010年版二部中的替硝唑原料藥［13］和醋酸氯己定原料藥［13］采用容量分析方法，筆者嘗試建立了同時測定替硝唑和醋酸氯己定的高效液相色譜方法，該方法具有良好的專屬性、精密性和準(zhǔn)確性，以及良好的分離效能，為復(fù)方氯倍他索乳膏的質(zhì)量控制提供了可靠的依據(jù)。

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R 917

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1002-7386(2015)02-0290-02

2014-09-11)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．051

100048北京市，中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科

劉皈陽，100048中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科; E-mail:liuguiy@live.cn