多藥耐藥相關(guān)蛋白在乳腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)研究

李易明 劉宇琨 劉競(jìng) 劉釗 高璇 王宏 李文建

·論著·

多藥耐藥相關(guān)蛋白在乳腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)研究

李易明 劉宇琨 劉競(jìng) 劉釗 高璇 王宏 李文建

目的檢測(cè)健康人和乳腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)基因的表達(dá)水平，探討MRP在乳腺癌患者中的可能作用。方法抽取20例健康人和50例乳腺癌患者外周血，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)2組實(shí)驗(yàn)對(duì)象血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素6(IL-6)細(xì)胞因子的含量;提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMCs)，后用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)BCRP和MRP2/3/4/5 mRNA和相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果ELISA法檢測(cè)乳腺癌患者外周血血清中TNF-α、IL-8、IL-6細(xì)胞因子的含量明顯高于健康人對(duì)照組(P＜0.05);熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BCRP和MRP5的mRNA表達(dá)水平高于健康人對(duì)照組(P＜0.05)，其余MRP沒(méi)有顯著性差別(P＞0.05);Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)與mRNA結(jié)果一致。結(jié)論乳腺癌患者外周血中的促炎因子含量的升高與BCRP和MRP5的表達(dá)調(diào)控有一定關(guān)系，具體相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

乳腺腫瘤;外周血;單個(gè)核細(xì)胞;多藥耐藥相關(guān)蛋白

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，當(dāng)前其發(fā)病率有明顯增長(zhǎng)的趨勢(shì)，現(xiàn)已躍居全球女性發(fā)病率排行之榜首，占全身惡性腫瘤7%～10%。目前仍以手術(shù)切除加化療為主要的治療手段，從而降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。但由于腫瘤多藥耐藥性(multidurg resistance，MDR)的產(chǎn)生，導(dǎo)致乳腺癌患者復(fù)發(fā)率高，化療的療效欠佳。腫瘤多藥耐藥的機(jī)制涉及多個(gè)因素［1］，其中能降低胞漿或胞核中毒性藥物濃度的ABC(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族備受研究者關(guān)注。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全稱為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一類特殊蛋白［2.3］，其能與ATP結(jié)合并水解釋放能量。這些跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠介導(dǎo)多種底物分子(糖類、氨基酸、金屬離子、小分子肽、蛋白以及疏水性化合物)在細(xì)胞內(nèi)外的運(yùn)輸［4］。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中有10種與耐藥密切相關(guān)的基因［5，6］。這10種基因有可能是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的重要防御機(jī)制。因此，逆轉(zhuǎn)MDR成為腫瘤研究中的重要課題。研究表明，在正常組織和腫瘤組織中均有MRP的存在［7，8］，但是對(duì)MRP在骨髓和外周血中分布情況，鮮有報(bào)道。本課題以健康人和乳腺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞為研究對(duì)象，運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡法檢測(cè)PBMCs中的MRP，從mRNA和蛋白水平檢測(cè)多藥耐藥相關(guān)蛋白在PBMCs中的表達(dá)，比較它們之間的差異，從而找出可能在乳腺癌耐藥中起關(guān)鍵作用的耐藥基因，為臨床治療乳腺癌提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料觀察對(duì)象為2011年4月至2012年4月石家莊市第一醫(yī)院普外科門診確診的乳腺癌患者共50例，年齡54～81歲，平均年齡(68±8)歲;對(duì)照組20例，為本院體檢中心經(jīng)健康體檢合格的健康人，無(wú)心、肝、肺、腎等重要臟器疾患，肝腎功能試驗(yàn)正常，亦無(wú)自身免疫性疾病和感染，年齡52～82歲，平均年齡(67± 7)歲。2組一般資料具有均衡性。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備NycoprepTM1.077A人淋巴細(xì)胞分離液(挪威Axisshield公司);Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I Master(日本TOYOBO公司);測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素-6(IL-6)的ELISA試劑盒、鼠抗人BCRP和MRP2/3/4/5單抗(美國(guó)eBioscience公司);蛋白酶抑制劑、去磷酸化酶抑制劑和βactin抗體(美國(guó)Sigma公司);Western blot試劑和標(biāo)準(zhǔn)Marker(美國(guó)Bio-Rad公司);實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);蛋白電泳(美國(guó)Bio-Rad公司)

1.3 標(biāo)本采集采集健康正常人和乳腺癌患者靜脈血30 ml，采集后1 h內(nèi)，吸出血清，分裝Eppendorf管，置-20℃冰箱保存。另抗凝留取靜脈血，以密度梯度離心法分離外周血PBMCs。

1.4 外周血提取單個(gè)核細(xì)胞將收集的約30 ml肝素抗凝的外周血用Hark’s液稀釋1倍，緩慢加到NycoprepTM1.077A人淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，吸取中間白膜層，提取單個(gè)核細(xì)胞。

1.5 血清中促炎因子的ELISA檢測(cè)收集外周血上清，TNF-α、IL-8、IL-6濃度的檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA法，具體操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 MRP mRNA表達(dá)水平的定量分析用Trizol裂解單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA，取1 μg總RNA在反應(yīng)體積為10 μl的逆轉(zhuǎn)錄管中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，5×ExScriopt buffer 2 μl，dNTP Mixture 0.5 μl，Oligo dT 0.5 μl，Ex-Scriopt RTase 0.5 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，RNase free water up to 10 μl。反轉(zhuǎn)錄條件為65℃10 min，42℃溫育60 min，72℃10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)，-20℃保存。用Real-time PCR Master Mix kit進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，包括cDNA，上下游引物，SYBR Green Real-time PCR Master Mix。按下反應(yīng)體系進(jìn)行:5 μl cDNA，0.3 μl上下游引物，7.5 μl SYBR Green，水補(bǔ)齊至15 μl。反應(yīng)條件如下:95℃60 s，95℃15 s，40循環(huán)，60℃60 s。數(shù)據(jù)分析以人GAPDH表達(dá)量為參照采用△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物見表1。

表1 Real-time PCR檢測(cè)基因引物序列

1.7 Western blot蛋白印跡用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液后進(jìn)行蛋白定量。制備的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，再以400 mA恒流電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗4℃孵育過(guò)夜，次日TBS-T洗滌3次，10 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再TBS-T洗滌3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光檢測(cè)信號(hào)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)健康正常人和乳腺癌患者的外周血血清中的TNF-α、IL-8、IL-6的含量。乳腺癌患者血清中炎性因子含量明顯高于健康正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.2 MRP mRNA在健康正常人和乳腺癌患者外周血

PBMCs中的表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組外周血PBMCs中的BCRP和MRP 2/3/4/5的mRNA的表達(dá)。各MRP及GAPDH的PCR產(chǎn)物熔解曲線呈單一峰，峰形狀銳利，說(shuō)明PCR產(chǎn)物特異性高，無(wú)雜帶。健康人PBMCs中BCRP和MRP2-5mRNA表達(dá)很低，乳腺癌患者PBMCs中，BCRP和MRP2-5mRNA表達(dá)均高于健康人組，但BCRP和MRP5的mRNA表達(dá)要明顯高于健康人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);MRP2、MRP3和MRP4的mRNA表達(dá)和健康組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表2 人血清中細(xì)胞因子的含量ng/L，±s

表2 人血清中細(xì)胞因子的含量ng/L，±s

注:與健康人組比較，*P＜0.05

組別TNF-αIL-8IL-6健康人組(n=20)15.0±2.819±418±3乳腺癌組(n=50)24.8±5.6*45±6*31±6*

表3 Real-time PCR檢測(cè)PBMCs中MRP mRNA的表達(dá)±s

表3 Real-time PCR檢測(cè)PBMCs中MRP mRNA的表達(dá)±s

注:與健康人組比較，*P＜0.05

組別BCRPMRP2MRP3MRP4MRP5健康人組(n=20)0.98±0.231.87±0.130.91±0.211.93±0.181.97±0.29乳腺癌組(n=50)8.21±2.35*1.97±0.110.92±0.191.99±0.094.82±1.79*

2.3 MRP蛋白產(chǎn)物在健康正常人和乳腺癌患者外周血PBMCs中的表達(dá)水平采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組外周血PBMCs中的BCRP和MRP2-5的蛋白表達(dá)水平的差異。檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)水平一致，乳腺癌患者PBMCs中BCRP和MRP5的灰度值分別為(1.98±0.47)和(1.86±0.51)，而健康人分別為(0.11±0.03)和(0.19±0.07)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示乳腺癌患者比正常人更易對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性。見圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)PBMCs MRP蛋白的表達(dá)

3 討論

臨床腫瘤學(xué)研究已表明，炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，15%～20%的腫瘤是由炎癥引起的［9-12］。同時(shí)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，炎癥可以誘導(dǎo)體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和活性改變。炎癥引發(fā)腫瘤的同時(shí)又可以使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和活性改變，這使得腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，也是腫瘤內(nèi)科治療失敗的主要原因。本研究中，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象血清中的促炎因子，闡明炎癥影響轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)及活性的是有一定的相關(guān)性。

MDR的產(chǎn)生涉及多個(gè)方面，多個(gè)環(huán)節(jié)及多條途徑，其中主要有兩方面的原因:一是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其將胞漿或胞核中毒性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞膜外，從而降低胞內(nèi)的毒性藥物濃度，二是腫瘤細(xì)胞中的化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)和凋亡通路的激活被抑制。過(guò)去炎癥對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)的研究重點(diǎn)一直是癌變的組織、細(xì)胞中MDR的分布及調(diào)節(jié)。Patrick等［7］用IL-1β、IL-6刺激HepG2后，檢測(cè)到MRP1蛋白表達(dá)量和功能活性增加。Kohno等［11］研究表明LPS刺激大鼠后，Mrp1 mRNA表達(dá)水平增加，而在人單細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞中，gp120誘導(dǎo)及分泌的TNF-α和IL-6與MRP1的mRNA表達(dá)無(wú)關(guān)。但關(guān)于人外周血中炎性因子對(duì)BCRP及MRP2/3/4/5調(diào)控的研究報(bào)道很少。

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示乳腺癌患者PBMCs中BCRP、MRP5 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于健康正常人組，也高于其他MRP。最近分子靶向治療研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控各種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)［13，14］。Kim等［14］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制NF-κB和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，從而下調(diào)MDR1的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BCRP、MRP5的表達(dá)上調(diào)可能是乳腺癌患者外周血中的促炎因子與PBMCs表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活NF-κB，其使細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性細(xì)胞因子，從而使BCRP、MRP5的表達(dá)上調(diào)，降低抗腫瘤藥物的療效。

文獻(xiàn)報(bào)道，化療藥物可以使腫瘤細(xì)胞中RAS癌基因表達(dá)增加，其激活PI3K/AKT通路，活化的PI3K/ AKT通路激活NF-κB，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，釋放出的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)MRP的表達(dá)和功能活性，從而出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥性［15，16］。其機(jī)制可能是化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也有造成一定的損傷，是其細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，從而釋放住一些細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過(guò)相應(yīng)受體進(jìn)行介導(dǎo)炎性反應(yīng)，激活NF-κB，進(jìn)一步釋放細(xì)胞因子來(lái)改變MRP的表達(dá)和活性功能，其將輸入的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物從細(xì)胞中泵出，從而產(chǎn)生耐藥效應(yīng)。

綜上所述，本研究分析了乳腺癌患者外周血中MRP的mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌患者外周血中MRP的異常表達(dá)很可能與促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6有密切關(guān)系，但促炎因子如何影響MRP，以及通過(guò)何種信號(hào)通路調(diào)節(jié)MRP有待進(jìn)一步研究。

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Expressions of multidrug resistanc-associated protein in peripheral blood mononuclear cells in patients with breast

cancer

LI Yiming*，LIU Yukun，LIU Jing，et al．Hebei Mechical University，Shijiazhuang 050031，China

ObjectiveTo investigate the expression of multidrug resistance-associated protein(MRP)in peripheral blood monouclear cells(PBMCs)of healthy people and patients with breast cancer，and to explore their possible roles in the pathogenesis of breast cancer.MethodsThe levels of TNF-α，IL-8 and IL-6 in serum were detected by ELISA in 50 patients with breast cancer(patients group)and 20 healthy subjects(control group).After the PBMCs in both groups were extracted，the expression levels of breast cancer resistance protein(BCRP)and MRP2/3/4/5 mRNA were detected by Real-time quantitative RT-PCR and Western blotting.ResultsThe levels of TNF-α，IL-8 and IL-6 in patients group were significantly higher than those in control group(P＜0.05).The expression levels of BCRP and MRP5 mRNA were significantly increased，as compared with those in control group(P＜0.05)，however，there were no significant differences in the other kinds of MRP between two groups(P＞0.05).ConclusionThe increase of proinflammatory factors in peripheral blood of patients with breast cancer may be correlated to the expressions of BCRP and MRP5，however，the related mechanism needs to be studied further.

breast neoplasms;peripheral blood;PBMCs;MRP

R 737.9

A

1002-7386(2015)02-0176-04

2014-05-30)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．004

050031石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院(李易明、劉釗);石家莊經(jīng)濟(jì)學(xué)院華信學(xué)院(劉宇琨);河北省石家莊第一醫(yī)院普外一科(劉競(jìng));河北醫(yī)科大學(xué)(高璇、李文建);河北省保定市第一中心醫(yī)院分院(王宏)

李文建，050017河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室; E-mail:liwenjian969@sohu.com