得力生通過調(diào)節(jié)血管蛋白抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖并促凋亡

孫海鳳，黎 明，趙 征，郭亞煥，楊廣寧，薛 麗，雷寶霞，南克俊

（1.陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西西安 710061；4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061）

得力生通過調(diào)節(jié)血管蛋白抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖并促凋亡

孫海鳳1，2，黎 明3，趙 征1，郭亞煥1，楊廣寧1，薛 麗2，雷寶霞1，南克俊4

（1.陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西西安 710061；4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061）

目的 探討得力生注射液對肝癌SMMC-7721細(xì)胞的作用機(jī)制。方法 用不同濃度的得力生作用肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，MTT方法檢測肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間（24、48、72 h）的增殖情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測肝癌SMMC-7721細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGE）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和內(nèi)皮抑素（endostadin，ENS）的表達(dá)。結(jié)果 得力生作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖逐漸減少，細(xì)胞凋亡逐漸增加，而對正常肝細(xì)胞HL-7702的作用很輕微。得力生將肝癌SMMC-7721細(xì)胞主要阻滯在G1期，且VEGE和OPN表達(dá)下調(diào)，ENS表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 得力生抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)，并可能通過調(diào)節(jié)血管蛋白而實(shí)現(xiàn)，這為得力生治療肝癌提供了理論依據(jù)。

得力生；凋亡；細(xì)胞周期；肝癌；血管內(nèi)皮生長因子（VEGE）；骨橋蛋白（OPN）；內(nèi)皮抑素（ENS）

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球第5位［1］。手術(shù)切除和肝移植等外科治療仍是首選治療方式，然而并不適合于進(jìn)展期肝癌［2］。另外，肝癌本身對化療不敏感，容易發(fā)生原發(fā)耐藥，對于提高生存期作用甚微［3］。因此，探索新的藥物和治療方法迫在眉睫。中國傳統(tǒng)的許多中藥已經(jīng)顯示出了潛在的抗癌作用，作為一種新的腫瘤治療方法引起了廣泛的關(guān)注［4-7］。得力生注射液作為我國的中草藥復(fù)方制劑正越來越引起學(xué)者的關(guān)注，并給予了科學(xué)的評價(jià)，但具體的分子機(jī)制尚不明確。

早期腫瘤進(jìn)展時(shí)，血管開關(guān)的平衡起著重要作用，血管生成由促進(jìn)血管生成的血管蛋白和抑制血管生成的血管蛋白共同決定［8］。以前的研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGE）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和內(nèi)皮抑素（endostadin，ENS）都參與了腫瘤血管的生成，然而，在肝癌細(xì)胞中的相關(guān)作用還不確定。本研究分別選取了肝癌SMMC-7721細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞株，觀察得力生對其增殖和凋亡的影響，以及VEGE、OPN和ENS蛋白的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞株（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；小牛血清（中美合資蘭州民海生物公司）；噻唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma）；得力生注射液（DLS）（北京正邦制藥有限公司）；鼠抗人VEGE和OPN，兔抗人ENS單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；SP免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞株分別接種在RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再加入100 m L/L胎牛血清、100 u/m L青霉素和100 mg/m L鏈霉素。然后放在37℃、50 m L/L CO2濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活性取對數(shù)生長期、密度為2×105個(gè)/mL的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞株150μL，接種在96孔培養(yǎng)板上。再分別加入終質(zhì)量濃度為25、50、100μL/mL的得力生（溶于含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基），各設(shè)4個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)空白對照組（僅加入等體積培養(yǎng)液）。培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去藥液及培養(yǎng)液，分別加入MTT 20μL（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后傾去藥液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，放置在振搖儀上振搖100 min，然后在酶標(biāo)儀上檢測（490 nm波長）每個(gè)孔吸光度值（用A值表示），根據(jù)A值計(jì)算抑制率。其中，抑制率（%）=（1—A/A0）×100%，A表示得力生各組的吸光度值（平均值），A0表示空白對照組的吸光度值（平均值）。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測將對數(shù)生長期的SMMC-7721和HL-7702接種于6孔板，孵育24 h后，分別加入終質(zhì)量濃度為25、50、100μL/m L的得力生（溶于含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別收集各組細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2遍，收集1×105～1×106個(gè)細(xì)胞，加入400μL的結(jié)合緩沖液，5μL Annexin V/EITC混勻后，再加入10μL的碘化丙啶，室溫狀態(tài)下且黑暗中染色15 min后，再加入300μL結(jié)合緩沖液，然后用EACS檢測，并使用Cell Quest Research Software軟件分析結(jié)果。

1.5 細(xì)胞周期檢測將處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，孵育48 h后，加入終質(zhì)量濃度為25μL/mL的得力生，分別設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清，再加入700 m L/L預(yù)冷乙醇中固定，吹打均勻，4℃固定48 h以上，1 000 r/min，離心5 min后棄乙醇，PBS洗滌2遍，0.5 m L PBS重懸細(xì)胞后，加入Rnase A 150μL和碘化丙啶100μL染液，室溫暗室中染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 檢測VEGF、OPN和ENS的表達(dá)檢測25、50、100μL/m L得力生作用人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的表達(dá)情況，鼠抗人VEGE、OPN和兔抗人ENS單克隆抗體按照1∶25倍稀釋，用PBS代替一抗作為對照。加一抗4℃過夜，然后用PBS沖洗3次后，加入二抗在室溫下放置20 min，再次PBS沖洗，再加入辣過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素液，37℃孵育30 min，DAB顯色5 min后，選取陽性區(qū)域照相和灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以±s表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 得力生對SMMC-7721和HL-7702細(xì)胞株的增殖抑制效應(yīng)得力生各組均抑制SMMC-7721增殖，呈時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)，且與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。25μL/mL的得力生作用SMMC-7721細(xì)胞株24 h的抑制率較低，100μL/mL時(shí)抑制率最高82.62%，而正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞株對得力生不敏感，抑制率較低（表1）。

2.2 得力生對細(xì)胞凋亡的影響得力生（25、50、100 μL/mL）作用于SMMC-7721細(xì)胞株24 h后，早期凋亡率分別是22.54%、26.17%和31.44%；對照組僅為3.48%。而正常肝細(xì)胞HL-7702凋亡很少（表2）。

表1 得力生對SMMC-7721和HL-7702細(xì)胞株增殖的抑制作用Tab.1 Growth-inhibiting effects of Delisheng on SMMC-7721 and HL-7702 cell lines（±s，n=4）

表1 得力生對SMMC-7721和HL-7702細(xì)胞株增殖的抑制作用Tab.1 Growth-inhibiting effects of Delisheng on SMMC-7721 and HL-7702 cell lines（±s，n=4）

標(biāo)注相同數(shù)字的組間比較，其P值分別為：①P=1.67×10-4；②P=4.03×10-5；③P=1.40×10-6；④P=5.94×10-6；⑤P=1.59×10-6；⑥P=3.94×10-7；⑦P=5.82×10-6；⑧P=3.13×10-8；⑨P=9.38×10-9。

細(xì)胞株得力生（μL/mL）抑制率（%）24 h 48 h 72 h SMMC-7721 25 25.34±4.22①35.12±10.33②46.19±9.32③50 39.67±3.65④43.34±8.45⑤51.57±5.62⑥100 54.78±5.77⑦64.83±7.22⑧82.62±3.25 HL-7702⑨25 11.23±3.26①13.13±3.22②15.21±2.44③50 15.89±6.35④20.12±7.04⑤23.89±6.54⑥100 20.54±5.32⑦22.84±5.43⑧24.29±4.58⑨

表2 得力生對SMMC-7721和HL-7702細(xì)胞株凋亡的影響Tab.2 Apoptosis-inducing effects of Delisheng on SMMC-7721 and HL-7702 cell lines（±s，n=4）

表2 得力生對SMMC-7721和HL-7702細(xì)胞株凋亡的影響Tab.2 Apoptosis-inducing effects of Delisheng on SMMC-7721 and HL-7702 cell lines（±s，n=4）

兩細(xì)胞株組間比較的P值分別為：①P=2.46×10-5；②P=2.05×10-6；③P=4.91×10-6。

細(xì)胞株早期凋亡率（%）對照組得力生（25μL/mL）①得力生（50μL/mL）②得力生（100μL/mL）③SMMC-7721 3.48±0.98 22.54±4.45 26.17±4.24 31.44±3.09 HL-7702 2.31±1.44 8.99±3.12 9.15±2.55 11.37±2.67

2.3 得力生對細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測得力生25μL/m L作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h，G1期細(xì)胞增多，伴隨著S期細(xì)胞比例減少，G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞分別占68.4%、22.1%和8.5%，而對照組分別是20.94%、61.67%和17.3%，其中組間G0/G1與S期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 得力生與對照組對SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞周期的改變Tab.3 Changes of cell cycle of SMMC-7721 cells in control and Delisheng groups（±s，%，n=4）

表3 得力生與對照組對SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞周期的改變Tab.3 Changes of cell cycle of SMMC-7721 cells in control and Delisheng groups（±s，%，n=4）

與對照組比較，*P=3.25×10-8。

組別G0/G1期S期G2/M期得力生組68.40±5.70*22.10±2.20*8.50±2.10對照組20.94±1.20 61.67±6.10 17.30±2.80

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果VEGE、OPN和ENS蛋白在SMMC-7721的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。對VEGE、OPN和ENS蛋白陽性的樣本行圖像分析，測其灰度值作為其表達(dá)強(qiáng)度的量化指標(biāo)?；叶戎蹬c實(shí)際表達(dá)強(qiáng)度成反比，即灰度值越低，陽性表達(dá)越強(qiáng)；灰度值越高，陽性表達(dá)越弱。25、50、100μL/m L得力生處理SMMC-7721后VEGE和OPN隨濃度增高其表達(dá)逐漸降低，其降低呈濃度依賴效應(yīng)，但其降低差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.904）。而ENS的表達(dá)隨著藥物濃度的增加逐漸增高，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 7.90×10-8，表4和圖1）。

表4 得力生處理SMMC-7721細(xì)胞株后VEGF、OPN和ENS的表達(dá)Tab.4 VEGE，OPN and ENS expressions in SMMC-7721 cell lines treated with Delisheng（±s，n=4）

表4 得力生處理SMMC-7721細(xì)胞株后VEGF、OPN和ENS的表達(dá)Tab.4 VEGE，OPN and ENS expressions in SMMC-7721 cell lines treated with Delisheng（±s，n=4）

標(biāo)注相同數(shù)字的組間比較，其P值分別為：①P=3.73×10-4；②P=1.61×10-5；③P=7.75×10-7。

蛋白平均灰度值對照組得力生（25μL/mL）得力生（50μL/mL）得力生（100μL/mL）VEGE 182.35±6.37 189.33±5.12 198.87±7.68 212.43±10.25 OPN 185.42±5.29 191.27±6.52 199.46±4.87 214.16±7.33 ENS 148.66±7.25①141.31±3.69①②134.54±4.27②③128.56±4.67③

圖1 VEGF、OPN和ENS在SMMC-7721細(xì)胞株中的表達(dá)Eig.1 Expressions of VEGE，OPN and ENS in SMMC-7721 cells（×200）

3 討 論

得力生是一種中藥復(fù)方制劑，由人參、黃芪、蟾酥、斑蝥組成，這些藥物可以單獨(dú)或聯(lián)合化療用于肝癌或其他腫瘤的治療。人參皂甙Rg3是從人參根提取的生物活性成分，據(jù)報(bào)道對于各種癌癥模型均有抗癌活性，如對前列腺癌細(xì)胞有抗增殖作用［9］。蟾酥不僅對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株有抑制作用，而且可以通過激活Caspase-3，上調(diào)Bax、下調(diào)livin和Bcl-2誘導(dǎo)其凋亡，抑制Jak-stat3信號(hào)通路可能是蟾酥最重要的誘導(dǎo)凋亡機(jī)制［10］。我國的臨床研究表明，得力生具有清除血液淤滯和提高免疫的功效，當(dāng)單獨(dú)使用得力生，每月10 d靜脈滴注時(shí)，發(fā)現(xiàn)它可以緩解虛弱等某些癥狀，提高生活質(zhì)量，延長生存期和降低80%前列腺癌患者的PSA水平［11］。

在健康組織中，細(xì)胞周期的進(jìn)展和凋亡被認(rèn)為是保持體內(nèi)平衡的兩個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)機(jī)制，許多抗癌機(jī)制和DNA損傷機(jī)制都是阻滯細(xì)胞周期在G0/G1、S或者G2/M期，然后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［14-17］。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)證明得力生以時(shí)間和濃度依賴的方式，通過死亡受體誘導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞株凋亡［12-13］。本研究進(jìn)一步觀察其對人肝癌SMMC-7721和正常肝細(xì)胞HL-7702的作用及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)得力生阻滯SMMC-7721細(xì)胞株至G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)一步的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然而對于正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞株的影響甚微。這點(diǎn)說明得力生對正常肝細(xì)胞的毒性作用甚小。

VEGE和OPN能夠直接誘導(dǎo)腫瘤血管的生成，這對實(shí)體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的［18］。VEGE是一個(gè)強(qiáng)有力的血管生成因子，在腫瘤血管生成中扮演重要角色。VEGE產(chǎn)生許多生物學(xué)效應(yīng)，包括內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的發(fā)生和遷移，蛋白酶誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，增加血管通透性和維持心血管形成的生存［19］。在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)VEGE高表達(dá)，其表達(dá)增加可以增強(qiáng)腫瘤的侵襲性、血管密度、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)［19-20］。OPN是一個(gè)磷酸化的酸性糖蛋白，結(jié)合一些CD44變體和整合素受體［21-22］。有學(xué)者曾報(bào)道，對于Ⅰ期肺癌患者，VEGE和OPN共表達(dá)與血管生成相關(guān)，更重要的是，VEGE和OPN陽性的患者術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后差的機(jī)會(huì)增加［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，得力生作用SMMC-7721細(xì)胞株后，以濃度依賴的方式下調(diào)VEGE和OPN。本課題組的前期研究亦證實(shí)其他中藥作用于肝癌HepG2細(xì)胞后可使OPN表達(dá)下調(diào)［24］。ENS能夠與多種細(xì)胞表面分子相互作用，與低級(jí)別的星形細(xì)胞瘤相比，IV級(jí)星形細(xì)胞瘤內(nèi)皮抑素表達(dá)減少［25-26］。ENS作為一種血管生成抑制劑，已被證明在體外可以抑制VEGE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［27-28］。研究發(fā)現(xiàn)，得力生作用于SMMC-7721細(xì)胞株后可見ENS表達(dá)上調(diào)，這可能是人參或蟾蜍的活性抵抗了血管的生成，需要在今后的實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步的證實(shí)。

本研究有力證實(shí)了得力生可以通過下調(diào)VEGE和OPN以及上調(diào)ENS的表達(dá)來抑制和誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞株的增殖與凋亡，也提供了一條新的治療肝癌以及其他實(shí)體瘤的途徑，而且也間接證實(shí)了祖國傳統(tǒng)中藥對正常肝細(xì)胞的低毒效應(yīng)，可讓患者放心使用。

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（編輯 國 榮）

Delisheng injection induced anti-proliferative and pro-apoptotic effects on SMMC-7721 cells through regulating angiogenic proteins

SUN Hai-feng1，2，LI Ming3，ZHAO Zheng1，GUO Ya-huan1，YANG Guang-ning1，XUE Li2，LEI Bao-xia1，NAN Ke-jun4
（1.Tumor Hospital of Shaanxi Province，Xi'an 710061；2.Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061；3.Department of Cardiovascular Surgery；4.Department of Oncology，the Eirst Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061，China）

Objective To investigate the possible anti-cancer mechanisms of Delisheng injection on hepatocellular carcinoma（HCC）cell line SMMC-7721.Methods Different concentration of Delisheng injection was administered on HCC cell line SMMC-7721.The cancer cell proliferation was measured by MTT assay.The apoptosis and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry.The expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF），osteopontin（OPN）and endostadin（ENS）in SMMC7721 cells were detected by immunocytochemistry staining.Results Delisheng injection treatment resulted in a significant decrease in cell proliferation and induced apoptotic cell death with the increase of treatment time and drug concentration. Additionally，Delisheng inhibited the proliferation of HCC SMMC-7721 cells strongly and the viability of normal liver HL-7702 cells slightly.Delisheng primarily arrested SMMC-7721 cells at the G1 phase of the cell cycle. Immunocytochemistry staining showed that VEGF and OPN expressions were downregulated whereas ENS expression was upregulated.Conclusion Delisheng inhibits the proliferation of HCC SMMC-7721cells and induces their apoptosis in dose-and time-dependent manners.This effect may be realized by regulating angiogenic proteins，which provides experimental evidence for the treatment of HCC with Delisheng.

Delisheng；apoptosis；cell cycle；hepatocellular carcinoma；vascular endothelial growth factor（VEGF）；osteopontin（OPN）；endostadin（ENS）

R735.7

A

10.7652/jdyxb201505025

2015-01-11

2015-03-25

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014JM4183）Supported by the Natural Science Basic Research Project of Shaanxi Province（No.2014JM4183）

南克俊.E-mail：nankj@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150804.1240.002.html（2015-08-04）