NLCM純化的不同分化程度賁門腺癌細胞差異蛋白質(zhì)組學研究

程 妍，李 陽，劉 冬，宋亞華，張 軍，龔 均

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.耳鼻咽喉頭頸外科，陜西西安 710004）

NLCM純化的不同分化程度賁門腺癌細胞差異蛋白質(zhì)組學研究

程 妍1，李 陽2，劉 冬1，宋亞華1，張 軍1，龔 均1

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院：1.消化內(nèi)科；2.耳鼻咽喉頭頸外科，陜西西安 710004）

目的 聯(lián)合導向激光捕獲顯微切割技術(shù)（NLCM）及蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較分析高分化賁門腺癌細胞和低分化賁門腺癌細胞的蛋白質(zhì)表達圖譜差異，尋找與賁門腺癌惡性程度和預后有關(guān)的分子標志物。方法 應用導向激光捕獲顯微切割技術(shù)分別獲取高分化和低分化賁門腺癌細胞，提取蛋白質(zhì)，應用雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)分離蛋白質(zhì)，選定差異點，膠內(nèi)酶解后，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOE MS）鑒定差異蛋白質(zhì)，并用免疫組化方法驗證差異蛋白的表達。結(jié)果 ①NLCM分別分離純化了高分化和低分化賁門腺癌細胞；②建立了高分化和低分化賁門腺癌細胞的蛋白質(zhì)表達圖譜，兩組分別檢測到（846±52）個和（923±84）個蛋白質(zhì)點，兩組的匹配率為85.4%；③對高分化和低分化的賁門腺癌蛋白質(zhì)表達譜進行比較分析，鑒定出10種差異蛋白，其中6個蛋白質(zhì)在低分化賁門腺癌細胞中表達上調(diào)，4個蛋白質(zhì)在低分化賁門腺癌細胞中表達下調(diào)；④差異蛋白質(zhì)涉及細胞間信號轉(zhuǎn)導、細胞代謝、凋亡及遷移等；⑤進一步通過免疫組化方法驗證了差異蛋白HSP27的表達與蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果一致。結(jié)論 高分化和低分化賁門腺癌間存在蛋白質(zhì)表達的差異，這些差異表達的蛋白質(zhì)可能與賁門腺癌的惡性程度和預后有關(guān)。

賁門腺癌；激光捕獲顯微切割；蛋白質(zhì)組學；分子標志物

自20世紀70年代中期以來，世界許多國家和地區(qū)食管下段腺癌和賁門腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1-2］。賁門腺癌早期癥狀不明顯，確診時多已屬晚期。由于其解剖部位特殊，與遠端胃癌相比，手術(shù)切除難度較大，術(shù)后較容易出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移?；颊叩目傮w預后較差。根治術(shù)后的5年生存率僅為30%左右，10年生存率低為3%～42%［3］。目前賁門腺癌癌變的機制尚不清楚。賁門腺癌的發(fā)生是一個多階段進行性發(fā)展的過程。蛋白質(zhì)組學（proteomics）是指應用各種手段來研究整個基因組編碼的全部蛋白質(zhì)的組成和活動規(guī)律的一門學科。采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析腫瘤蛋白質(zhì)種類、表達水平的改變，對揭示腫瘤發(fā)病機制以及發(fā)現(xiàn)腫瘤標志物具有十分重要的作用［4-5］。

賁門腺癌是由賁門腺癌細胞及各種間質(zhì)細胞所構(gòu)成的混合體。組織異質(zhì)性是蛋白質(zhì)組學研究面臨的一大問題。激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture microdissection，LCM）可選擇性的獲取特定目的細胞群，保證了樣品的純度和精確度，有效的解決了組織樣品的異質(zhì)性問題［6］。本研究前期已成功構(gòu)建了導向激光捕獲顯微技術(shù)（navigated laser capture microdissection，NLCM）在賁門腺癌蛋白質(zhì)組學研究的技術(shù)平臺［7］。在前期實驗基礎上，本研究將采用NLCM技術(shù)分離純化高分化和低分化賁門腺癌細胞，通過2-DE凝膠電泳和MALDI-TOE MS的方法，分離和鑒定出不同分化程度的賁門腺癌細胞表達的差異蛋白質(zhì)，為尋找與賁門腺癌惡性程度和預后有關(guān)的分子標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料9例賁門腺癌患者手術(shù)組織標本均來自西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院、唐都醫(yī)院和陜西省人民醫(yī)院胸外科，并經(jīng)病理醫(yī)師確診。所有患者在術(shù)前均未接受放療或化療，患者為50～80歲男性，平均年齡64歲。手術(shù)切除的賁門腺癌組織標本，-80℃保存。

1.2 冰凍切片制備用恒冷切片機制備8μm的賁門腺癌組織切片。

1.3 切片處理快速蘇木素染色（LCM導向組）：700 m L/L乙醇溶液固定冰凍切片，在含蛋白酶抑制劑的超純水浸泡1 min，蘇木素染色10～15 s，然后經(jīng)700 m L/L乙醇、950 m L/L乙醇、無水乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，室溫完全干燥。無染色（NLCM組）：除去蘇木素染色步驟，其余同前。

1.4 導向激光捕獲顯微切割采用PixCellⅡLCM系統(tǒng)，在顯微鏡下觀察用于LCM導向的染色切片，在感興趣的部位進行取圖作為導向圖，然后換上用于NLCM的組織切片，在導向圖的指引下進行捕獲。切割后的LCM組織切片行蘇木素染色，觀察捕獲結(jié)果，保證細胞捕獲效率在90%以上［7］。將塑料帽蓋到0.5 m L離心管上，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白提取在離心管中加入裂解液，將塑料帽扣在離心管上，4℃20 000 r/min離心1 h，提取上清液，Bradford法蛋白定量［7］。

1.6 雙向凝膠電泳在提取的蛋白質(zhì)樣本中加入水化液，在IPG phor等電聚焦儀上進行等電聚焦電泳，按如下條件：20℃，60μA/IPG strip，30 V 6 h、60 V 6 h、200 V 2 h、500 V 2 h、1 000 V 1 h、穩(wěn)定在8 000 V，總共30 000 Vh T；等電聚焦結(jié)束后分別在平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中平衡15 min；平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至110 g/L SDS-PAGE膠上端，在垂直電泳槽上進行第二向垂直電泳，電泳結(jié)束后進行銀染，實驗重復3次［］。

1.7 凝膠圖像分析用Image Master 2D Platinum Version 5.0凝膠分析軟件對圖像進行蛋白質(zhì)斑點檢測和匹配分析，比較分析高分化賁門腺癌細胞與低分化賁門腺癌細胞的2-DE圖譜差異，選取表達水平相差2倍以上的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析。

1.8 膠內(nèi)酶解將選取的蛋白質(zhì)點切成1 mm3大小放入離心管中，沖洗、脫色后，加入200μL的20 mmol/L DTT/25 mmol/L NH4HCO3，56℃還原1 h，室溫冷卻，加入等體積的55 mmol/L碘乙酰胺/ 25 mmol/L NH4HCO3，室溫避光震蕩45 min，再用乙腈脫水抽干；在冰上加入7～10μL的12.5 ng/μL胰酶溶液靜置20 min，加入適量25 mmol/L NH4HCO3靜置20 min，37℃過夜；加入50μL萃取液萃取15 min，吸取上清至另一離心管中，在余下的膠塊中重復萃取1次，收集萃取液，真空干燥抽干。

1.9 質(zhì)譜分析抽干的樣本用2 m L/L TEA溶液溶解，然后與10 mg/m L的CHCA基質(zhì)液按1∶2體積混合，充分混勻，吸取1μL，點于點樣板上，空氣中自然干燥；將樣品置于Voyager-DETMMALDI-TOE質(zhì)譜儀上進行分析，采用線性模式、正離子譜測定，設定離子源加速電壓為20 k V，質(zhì)譜信號單次掃描累加80次，用angiotensinⅡ（912.08 u）和insulin B chain（3 495.95 u）作為內(nèi)標。

1.10 數(shù)據(jù)庫搜索用Data Explorer軟件對肽質(zhì)量指紋圖譜進行分析，將結(jié)果輸入到http：//www.expasy.org/tools/aldente/，用Aldente軟件在SWISS-PROT和Tr EMBL數(shù)據(jù)庫中鑒定蛋白質(zhì)。

1.11 免疫組織化學染色免疫組織化學染色：按S-P免疫組化試劑盒說明進行。組織切片常規(guī)脫蠟、水化；于枸櫞酸鈉緩沖液中微波修復抗原；加入正常山羊血清封閉液；加入一抗HSP27（1∶500）4℃孵育過夜；加入SP免疫組化試劑盒中的生物素標記山羊抗兔IgG，37℃，孵育15 min；加入辣根過氧化物標記的鏈霉卵白素工作液，37℃，孵育15 min；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。采用Q550CW型圖像采集與分析系統(tǒng)測定灰度值進行結(jié)果判定。

1.12 統(tǒng)計學分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 通過NLCM技術(shù)獲得了高分化和低分化的賁門腺癌細胞采用NLCM技術(shù)分別從不同分化程度的賁門腺癌組織中成功分離出高分化和低分化賁門腺癌細胞。組織切片先經(jīng)HE染色確定賁門腺癌的組織分化類型，在快速蘇木素染色切片引導下進行顯微切割，從而將賁門腺癌細胞準確地捕獲至塑料帽的表面，切片上殘留非特異性間質(zhì)組織，細胞捕獲效率達90%以上（圖1）。

圖2 不同分化程度的賁門腺癌細胞2-DE圖譜Eig.2 2-DE protein pattern of well differentiated and poorly differentiated GCA

圖1 NLCM純化賁門腺癌細胞的過程Eig.1 Process of navigated laser capture microdissection of GCA tumor tissue

2.2 NLCM純化的高分化和低分化賁門腺癌細胞的2-DE表達圖譜的建立在相同的實驗條件和參數(shù)設置下，對各組蛋白質(zhì)樣品分別進行3次2-DE以保證實驗的重復性，得到高分化（A）和低分化（B）賁門腺癌細胞的2-DE圖譜（圖2），圖中兩者的蛋白質(zhì)表達譜類似，蛋白質(zhì)點多集中分布于等電點4.5～8.5和分子量85～28 ku之間。經(jīng)Image Master軟件分析，兩組平均檢測到的蛋白質(zhì)點數(shù)為：高分化組846 ±52、低分化組923±84，兩組的匹配率為85.4%。

2.3 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定情況在上述匹配的基礎上，結(jié)合肉眼觀察進行蛋白質(zhì)表達差異分析，篩選出差異≥2倍并具有統(tǒng)計學意義且在全部凝膠中存在的蛋白質(zhì)點10個。差異點標示在圖2中。將10個PMEs的質(zhì)量數(shù)據(jù)輸入到Aldente軟件中，查詢SWISS-PROT和Tr EMBL數(shù)據(jù)庫，結(jié)合雙向電泳蛋白質(zhì)點的表觀分子量及等電點數(shù)值，共鑒定出了10個差異蛋白質(zhì)，其中低分化腺癌比高分化腺癌上調(diào)6個蛋白質(zhì)（醛酮還原酶家族1C3、Bcl-2樣蛋白11、鋅指蛋白、GPR175、ATP合酶亞單位α、α肌動蛋白），下調(diào)4個蛋白質(zhì)（MEMO1、二甲基精氨酸二甲胺水解酶、熱休克蛋白27、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2），具體見表1。

表1 高分化與低分化賁門腺癌比較的差異蛋白Tab.1 Differential proteins between well differentiated and poorly differentiated GCA（±s）

表1 高分化與低分化賁門腺癌比較的差異蛋白Tab.1 Differential proteins between well differentiated and poorly differentiated GCA（±s）

*低分化的賁門腺癌細胞/高分化的賁門腺癌細胞。

編號蛋白質(zhì)比例（低分化/高分化）*P值表達上調(diào)的蛋白質(zhì)13 Aldo-keto reductase family 1member C3（AKR1C3）4.073 0±1.142 0 0.018 0 23 Bcl-2-likeprotein 11 4.075 6±0.474 3 0.003 0 20 Zinc finger EYVE domain-containing protein 1 3.779 4±0.473 6 0.002 0 21 Integral membrane protein GPR175 3.248 4±0.823 6 0.048 0 70 ATP synthase bunit alpha 2.652 9±0.433 5 0.001 0 22 Alpha-centractin 2.599 7±0.216 1 0.014 0表達下調(diào)的蛋白質(zhì)26 Protein MEMO1 0.334 9±0.043 1 0.007 0 47 NG，NG-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 0.368 7±0.084 8 0.023 0 1 Heat-shock protein beta-1（HSP27）0.284 2±0.023 5 0.002 0 37 Neureg0.329 7±0.026 3 0.006 0 ulin-2

2.4 差異蛋白質(zhì)的亞細胞定位及功能分類通過Swiss-Prot/Tr EMBL數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質(zhì)進行亞細胞定位（圖3）和功能分類（圖4）。10個差異蛋白質(zhì)的亞細胞定位：細胞質(zhì)蛋白3個，線粒體蛋白1個，細胞膜蛋白3個，高爾基體蛋白1個，未知2個。10個差異蛋白質(zhì)的功能分類涉及細胞代謝、分子伴侶、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導、細胞轉(zhuǎn)移及其他。

圖3 差異蛋白質(zhì)的細胞定位Eig.3 The subcelluar location of differential protein

2.5 差異蛋白質(zhì)表達水平的驗證情況為驗證蛋白質(zhì)組學研究的結(jié)果，分別選取12例高分化賁門腺癌患者和10例低分化賁門腺癌患者的病理組織切片，采用免疫組化方法檢測1號差異蛋白質(zhì)點HSP27在高分化和低分化賁門腺癌組織中的表達情況。結(jié)果顯示：HSP27在兩組中的表達量分別為140.516± 5.311和149.126±2.673，兩組間有顯著性差異（P＜0.05）。表明HSP27的表達與賁門腺癌的分化程度有關(guān)，在高分化賁門腺癌中的表達與低分化腺癌相比明顯升高。與蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果一致（表1）。

圖4 差異蛋白質(zhì)的功能分類Eig.4 The functional distribution of differential protein

3 討 論

本實驗應用NLCM與蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較高分化及低分化賁門腺癌腫瘤細胞中的蛋白質(zhì)表達差異，有助于發(fā)現(xiàn)與賁門腺癌惡性程度相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)不僅可為研究腫瘤發(fā)病機制提供線索，而且可作為腫瘤預后的生物標志物［8］。本研究發(fā)現(xiàn)的這些差異蛋白涉及多種功能，如細胞分子伴侶、參與細胞代謝、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導以及細胞轉(zhuǎn)移等。

3.1 熱休克蛋白熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一種在不良環(huán)境因素作用下產(chǎn)生的具有高度保守性的應激蛋白，普遍存在于整個生物界。按蛋白分子量大小，熱休克蛋白共分為五類，分別為HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins，s HSPs）（分子量在16～40 ku之間）等幾個主要家族。熱休克蛋白屬于細胞內(nèi)分子伴侶蛋白，對細胞應激、代謝、增殖以及凋亡等生理過程均具有重要的調(diào)控作用［9］。目前，已有較多HSPs與腫瘤相關(guān)的報道，如在胃癌［10-11］、食管鱗癌［12］、直結(jié)腸癌［13］及肝細胞癌［14］等腫瘤中HSPs均表現(xiàn)為過度表達。因此，HSPs是一項診斷腫瘤的有效指標［15］。與HSPs還與腫瘤的惡性程度有關(guān)，可作為獨立判斷多種腫瘤預后不良的分子指標。有研究報道HSP27與胃癌腫瘤分期、浸潤深度有關(guān)，在胃癌中HSP27高表達提示胃癌惡性程度高，預后不良。本實驗結(jié)果顯示HSP27在高分化賁門腺癌中表達高于低分化賁門腺癌，表明其可能與賁門腺癌的預后有關(guān)。

3.2 代謝酶醛酮還原酶家族1C3（aldo-keto reductase family 1member C3，AKR1C3）有顯著的11-醛酮還原酶活性，能轉(zhuǎn)化醛和酮變?yōu)榇?，并參與前列腺素的代謝過程，催化（PG）D2成為PGE2。（PG）D2具有化學不穩(wěn)定性，首先變?yōu)镻GJ2，后轉(zhuǎn)化成15-PGJ2，即過氧化物酶體活化受體γ（PPARγ）的天然配基，AKR1C3可調(diào)控細胞的分化與生長，是一種細胞分化抑制因子。已有報道顯示AKR1C3在胃癌、胰腺癌［16］、乳腺癌，前列腺癌［17］等多種腫瘤中高表達。利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)AKR1C3的表達還與TSGH-S3胃癌細胞對奧沙利鉑化療耐受有關(guān)［18］。AKR1C3的酶活性可被NSAIDs明顯抑制，成為NSAIDs的非環(huán)氧合酶依賴的抗腫瘤作用的靶點［19］。本研究發(fā)現(xiàn)AKR1C3在低分化腺癌表達高于高分化腺癌，提示AKR1C3可能與賁門腺癌的發(fā)展、化療效果及預后有關(guān)。AKR1C3在賁門腺癌化療耐受中的作用有待進一步研究。

3.3 線粒體相關(guān)蛋白線粒體是真核生物能量和代謝的中心，其內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)酶系，約占整個細胞蛋白質(zhì)種類的5%～10%，線粒體在調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡中起決定性作用。本實驗中鑒定出的ATP合酶亞單位α為線粒體蛋白，它廣泛分布于線粒體內(nèi)膜，參與氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜質(zhì)子動力勢的推動下合成ATP。在病理條件下，活性氧（ROS）生成明顯增加，Bax與bcl-2結(jié)合，線粒體滲透性轉(zhuǎn)變核孔（PTP）開放，細胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到胞質(zhì)中，caspase家族激酶激活，引起細胞凋亡的級聯(lián)反應［20］。此外，線粒體氧化磷酸化功能降低可促進腫瘤細胞增殖，線粒體呼吸酶復合體表達減少與腫瘤細胞侵襲性增加密切相關(guān)［21］。本研究顯示ATP合酶亞單位α在低分化腺癌中表達高于高分化腺癌，提示ATP合酶亞單位α可能與賁門腺癌的預后有關(guān)。

本研究應用比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選了不同分化程度的賁門腺癌組織間差異表達的10個蛋白質(zhì)，這些差異蛋白質(zhì)可能與賁門腺癌的發(fā)生及預后等有關(guān)。我們將進一步對差異表達的蛋白質(zhì)及其相關(guān)基因進行研究，將基因與蛋白質(zhì)相結(jié)合進行分析，為賁門腺癌的發(fā)生發(fā)展機制提供理論依據(jù)。

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（編輯 韓維棟）

Differential proteomics analysis of navigated laser capture microdissection of well and poor differentiated human gastric cardia adenocarcinoma

CHENG Yan1，LI Yang2，LIU Dong1，SONG Ya-hua1，ZHANG Jun1，GONG Jun1
（1.Department of Digestive Diseases；2.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004，China）

Objective To obtain protein biomarkers used for malignant degree and prognosis of human gastric cardiac adenocarcinoma（GCA）tissues captured by navigated laser capture microdissection（NLCM）and proteomics technology.Methods We performed navigated LCM to enrich the malignant gastric cardiac cells from surgical specimens of human GCA.The proteins extracted from these cells were then separated.Differential protein spots were identified by peptide mass fingerprint（PMF）based on matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）and database searching.To validate the expression patterns of HSP27，immunohistochemistry was performed using formalin-fixed and paraffin-embedded tissue specimens.Results ①We obtained the 2-DE patterns of high resolution and reproducibility of well（group A）and poorly（group B）differentiated human GCA tissues captured by NLCM.②The detected spots between them were as follows：846± 52 and 923±84 between group A and group B.The percentage of matched spots between them was 85.4%.③With mass spectrometry technology（peptide mass fingerprint），10 protein spots were successfully identified.Six proteins had significantly higher expression in poorly differentiated GCA than in well differentiated GCA.Another 4 proteins had a significantly lower expression in poorly differentiated GCA than in well differentiated GCA.④The identified proteins of GCA were classified in terms of their cellular localization and physiological function usinginformation from SWISS-PROT and NCBI websites.Most of the proteins were involved in cell signal transduction，cell metabolism，apoptosis and migration.⑤The expression of HSP27 in well differentiated GCA was higher than in poorly differentiated GCA group（P＜0.05），which was in agreement with proteomic results.Conclusion Ten differentially expressed proteins identified between the poorly differentiated and well differentiated GCA tissues indicate that they may be associated with the malignance degree of GCA and the prognosis of GCA.

gastric cardia adenocarcinoma；laser capture microdissection；proteomics；biomarker

R735.2

A

10.7652/jdyxb201505021

2015-04-26

2015-05-22

國家自然科學基金資助項目（No.30470785）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.30470785）

張軍.E-mail：jun3z@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.1604.008.html（2015-07-21）