苯妥英鈉對大鼠牙周膜干細胞遷移及成骨分化的影響

巴曉曄，何 珊，丁亞娟，楊亦婷，王寶彥

（1.西安高新醫(yī)院口腔科，陜西西安 710000；2.西安交通大學醫(yī)學部第二附屬

醫(yī)院口腔科，陜西西安 710004；3.西安交通大學醫(yī)學部口腔醫(yī)學院牙周黏膜病科，陜西西安 710004）

苯妥英鈉對大鼠牙周膜干細胞遷移及成骨分化的影響

巴曉曄1，何 珊2，丁亞娟2，楊亦婷2，王寶彥3

（1.西安高新醫(yī)院口腔科，陜西西安 710000；2.西安交通大學醫(yī)學部第二附屬

醫(yī)院口腔科，陜西西安 710004；3.西安交通大學醫(yī)學部口腔醫(yī)學院牙周黏膜病科，陜西西安 710004）

目的 在體內(nèi)微環(huán)境中研究局部應用苯妥英鈉對大鼠牙周膜干細胞遷移及成骨分化的影響。方法 54只SD雄性大鼠建立下頜骨創(chuàng)傷模型，創(chuàng)傷局部使用預定濃度的苯妥英鈉，將大鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組于術(shù)后通過舌下靜脈注入Brd U標記的大鼠牙周膜干細胞，對照組于術(shù)后通過舌下靜脈注入等量的PBS，每組每個濃度分別于術(shù)后1、2、4周時腹腔麻醉后脫頸處死大鼠3只，采用免疫組織化學染色和圖像分析軟件測定創(chuàng)傷區(qū)Brd U、骨橋蛋白（OPN）、RUNX2的表達，并用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行多因素方差分析。結(jié)果 40μg/m L PHT+rPDLSCs組和100 μg/m L PHT+rPDLSCs組Brd U陽性細胞數(shù)明顯多于20μg/m L PHT+r PDLSCs組與rPDLSCs，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；40μg/m L和100μg/m L PHT+r PDLSCs與rPDLSCs相比、PHT和空白組相比、PHT+r PDLSC與PHT相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；40μg/m L和100μg/m L PHT組OPN和RUNX2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 40μg/m L和100μg/mL PHT在骨組織修復的早期可以促進缺損附近的牙周膜干細胞遷移至缺損區(qū)域，并增殖分化為成骨細胞，促進骨組織的愈合。

牙周炎；牙周膜干細胞；苯妥英鈉；遷移；分化；骨橋蛋白；RUNX2；Brd U

目前，牙周組織再生的難點主要在于牙周病損部位殘存的健康牙周膜干細胞數(shù)量少、分化潛力有限，因此牙周組織能否完全再生，取決于損傷局部是否具有再生所需的各種細胞，以及是否存在趨化和誘導這些細胞進行分化的生長調(diào)控機制。牙周膜干細胞在牙周再生中發(fā)揮著重要作用［1-11］。研究發(fā)現(xiàn)，局部使用苯妥英鈉具有促進創(chuàng)傷愈合和降低創(chuàng)傷區(qū)細菌量的作用［12］；適宜濃度的苯妥英鈉可以促進牙周膜干細胞的增殖和分化、刺激多種細胞因子的生長和分泌、促進骨組織的合成和代謝［13］。為了解體內(nèi)微環(huán)境中局部應用苯妥英鈉對大鼠牙周膜干細胞遷移及成骨分化的影響設(shè)計了本研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPE級SD雄性大鼠，體質(zhì)量200 g，54只，100 g，5只，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及設(shè)備DMEM-E12培養(yǎng)基、胎牛血清（EBS），Ⅰ型膠原酶，兔抗大鼠CD45單克隆抗體，小鼠抗大鼠CD146單克隆抗體，小鼠抗大鼠CD90單克隆抗體、小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體，5-溴脫氧尿嘧啶核苷5-bromodeoxyuridine（Brd U），Brd U一抗，免疫組化試劑盒，RUNX2一抗，OPN一抗。Thermo Scienticfic Eorma CO2培養(yǎng)箱，低速渦輪手機。

1.3 大鼠牙周膜干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定將5只體質(zhì)量100 g左右的SD雄性大鼠的上下切牙采用常規(guī)的牙周膜酶消化+組織塊法獲取rPDLSCs，并用成骨和成脂誘導分化實驗以及流式細胞儀檢測CD146、CD90、CD34、CD45進行細胞鑒定。

1.4 Brd U標記r PDLSCs用第3代r PDLSCs制作細胞爬片，分別用含Brd U（終濃度為5、10、15、20μmol/L）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h后進行免疫細胞化學染色，通過Image ProPlus6.0圖像分析軟件進行細胞計數(shù)，SPSS 18.0統(tǒng)計分析，篩選Brd U標記rPDLSCs的最佳濃度及時間。

1.5 建立動物模型及細胞移植

1.5.1 實驗分組 如圖1所示，取54只SD雄性大鼠，體質(zhì)量200 g左右，隨機的分為實驗組和對照組，設(shè)定PHT為20、40、100μg/m L三種濃度，每組每個濃度各9只SD大鼠，分別于術(shù)后1、2、4周每組每個濃度處死3只大鼠。

1.5.2 建立SD大鼠下頜骨急性創(chuàng)傷模型 100 g/L水合氯醛，按0.3 mL/100 g腹腔麻醉后備皮、消毒，于兩側(cè)下頜骨下緣各做一2 cm的口外切口，切斷咬肌下頜骨下緣附著點，翻開咬肌和骨膜、暴露骨面，在第一磨牙根方在生理鹽水沖洗下用齒科低速4號球鉆小心制備骨缺損，缺損的大小為近遠中向（長）4 mm、冠根向（寬）2 mm、頰舌向（深）1.5 mm，用牙周探針標準化缺損大??；鹽水沖洗缺損區(qū)，無菌紗布吸干，一側(cè)缺損內(nèi)分別放入20、40、100μg/mL PHT的明膠海綿（放入藥物后不可擦拭缺損區(qū)域，以防吸出藥物），另一側(cè)放入含有鹽水的明膠海綿；分層復位縫合。術(shù)后3 d肌注16萬u青霉素鈉以預防感染。手術(shù)均由同一人完成（圖2）。

圖1 實驗分組Eig.1 Grouping for the experiment

1.5.3 細胞移植 ①Brd U標記rPDLSCs：待第3代r PDLSCs長至80%時，用含10μmol/L Brd U培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，制備密度為1×106/μL的細胞懸液，收集于EP管中，4℃待用。②細胞移植：經(jīng)舌下靜脈注入200μL Brd U標記r PDLSCs懸液；對照組經(jīng)舌下靜脈注入等量PBS。動物術(shù)后口服硫唑嘌呤45 mg/（kg·d）直至處死。

1.5.4 標本收集和處理 100 g/L水合氯醛0.3 m L/100 g腹腔麻醉后斷頸處死，分離兩側(cè)的下頜骨；標本經(jīng)固定、脫鈣、包埋后制備近遠中向5μm厚連續(xù)切片；HE染色進行定性分析；免疫細胞化學染色檢測缺損區(qū)域Brd U、OPN、RUNX2的表達；使用ImageProPlus軟件進行OPN、RUNX2的平均吸光度圖像分析及Brd U陽性細胞計數(shù)，SPSS 18.0進行多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Brd U標記r PDLSCs

2.1.1 Brd U標記r PDLSCs的形態(tài)學變化 光鏡下觀察，Brd U標記陽性的細胞胞核為棕黃色，而陰性細胞為無色。經(jīng)Brd U標記與未標記細胞相比，細胞呈長梭形，形態(tài)較規(guī)整，未見明顯改變（圖3）。

2.1.2 Brd U標記rPDLSCs的標記率 每組取細胞爬片6張，每張隨機取5個非重疊視野（×100），以染色陽性細胞核數(shù)目之比計算Brd U標記率，各組標記率計算結(jié)果見表1。經(jīng)SPSS18.0軟件進行多因素方差分析，濃度相同但時間不同的條件下，24 h的標記率與48、72 h相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），48 h與72 h間的標記率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在時間相同但濃度不同的條件下，5μmol/L與10、15、20μmol/L的標記率相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而10、15、20μmol/L的標記率之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究采用BrdU濃度為10μmol/L，標記48 h為最佳標記方法進行后續(xù)實驗。

圖2 動物模型的建立Eig.2 The establishment of animal model

圖3 Brd U標記與未標記細胞的形態(tài)學觀察Eig.3 Morphological observation of Brd U-labeled and non-labelled cells（×100）

表1 不同時間、濃度的Brd U標記率的比較Tab.1 Comparison of Brd U labelling rate at different time and concentration（±s，n=30）

表1 不同時間、濃度的Brd U標記率的比較Tab.1 Comparison of Brd U labelling rate at different time and concentration（±s，n=30）

24 h與48、72 h比較，*P＜0.05；5μmol/L和10、15、20μmol/L比較，△P＜0.05。

Brd U（μmol/L）陽性細胞標記率（%）24 h 48 h 72 h 5 90.29±2.62*△94.01±0.71△95.90±0.11△98.56±0.20 99.35±0.23 10 94.68±2.28*98.61±0.55 99.44±0.24 15 95.76±1.09*99.65±1.99 99.36±0.32 20 95.50±1.00*

2.1.3 MTT法繪制細胞生長曲線 經(jīng)Brd U標記的rPDLSCs和未標記的rPDLSCs總體呈“S”形。Brd U組與對照組相比，未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。說明Brd U標記后，細胞活力未受明顯影響（圖4）。

圖4 r PDLSCs細胞生長曲線Eig.4 Growth curve of r PDLSCs

2.2 動物模型的建立

2.2.1 大體觀察 大鼠在手術(shù)后30 min～1 h清醒，2 h后精神狀態(tài)及飲食狀態(tài)正常，傷口無裂開、紅腫及滲出，傷口愈合良好。細胞移植后大鼠生活行為未見異常。

2.2.2 HE染色觀察 術(shù)后1周，所有組可見骨缺損區(qū)邊界清晰，缺損內(nèi)有較為明顯的炎性細胞浸潤，PHT組較無PHT組炎細胞少，缺損內(nèi)充滿大量纖維結(jié)締組織，未見新生牙槽骨的形成。術(shù)后2周，炎細胞浸潤較為局限，20μg/m L PHT組部分纖維結(jié)締組織被新生的骨小梁取代，表面可見少量成骨細胞，未見明顯的骨島形成；40μg/m L和100μg/m L PHT組缺損內(nèi)可見大量新生的骨小梁連接成片形成大量的骨島，表面有大量的成骨細胞，無PHT組缺損內(nèi)僅有少量的新骨形成。術(shù)后4周，所有組缺損區(qū)邊界開始模糊，大量的骨島聚集在一起完成部分骨修復，成骨細胞活動減慢，數(shù)量較2周時減少（圖5）。

2.2.3 免疫組織化學染色 ①Brd U免疫組織化學染色：染色的陽性部位在細胞核，成棕黃色顆粒，陰性細胞核成藍色（圖6中箭頭所示）。使用ImageProP-lus進行各組陽性細胞數(shù)計算，并用SPSS 18.0進行多因素方差分析，結(jié)果顯示，各個濃度PHT組較無PHT側(cè)遷移細胞數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），40μg/m L和100μg/m L PHT組細胞數(shù)較20μg/m L多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），40 μg/m L和100μg/m L PHT組細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。②OPN免疫組織化學染色：染色的陽性部位在細胞質(zhì)，呈棕黃色，陰性細胞質(zhì)未著色（圖6）。使用Image ProPlus圖像軟件進行OPN平均吸光度值測定及SPSS 18.0進行多因素方差分析，結(jié)果顯示，20μg/mL PHT組中各組之間OPN的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；40μg/mL和100μg/mL中PHT+rPDLSCs與r PDLSCs相比、PHT和空白組相比、PHT+rPDLSC與PHT比較，均差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而術(shù)后4周時，所有組OPN的表達較2周時高，但組內(nèi)及組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3～表5）。③RUNX2免疫組織化學染色：染色的陽性部位在細胞核，成棕黃色顆粒，陰性染色細胞核成藍色（圖6）。使用Image ProPlus圖像軟件進行RUNX2平均吸光度值分析及SPSS18.0進行多因素方差分析，結(jié)果顯示，20μg/m L PHT組中各組之間RUNX2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；40μg/m L和100μg/m L中PHT+r PDLSCs與rPDLSCs相比、PHT和空白組相比、PHT+rPDLSC與PHT比較，均差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而術(shù)后4周時，所有組RUNX2的表達較2周時高，但組內(nèi)及組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表6～表8）。

圖5 40μg/mL PHT組的HE染色Eig.5 HE staining in 40μg/m L PHT group（HE，×10）

圖6 免疫組織化學染色Eig.6 Immunohistochemical staining（×40）

表2 術(shù)后各組陽性遷移細胞數(shù)的比較Tab.2 Comparison of the postoperative number of positive migrated cells in different groups（±s，n=15）

各組PHT+r PDLSCs與rPDLSCs比較，*P＜0.05；20μg/mL和40μg/mL及100μg/mL比較，#P＜0.05。

PHT PHT+rPDLSCs 1周2周4周rPDLSCs 1周2周 4周20μg/m L 0.78%3.61%*#3.67%*#0 2.05%2.66% 2.32%2.75% 40μg/m L 1.53%4.41%*4.53%*0 2.14%2.37% 100μg/mL 1.39%4.76%*4.19%*0

表3 術(shù)后1周PHT對OPN吸光度值的影響Tab.3 Effect of PHT at week 1 after operation on OPN absorbency value（±s，n=15）

表3 術(shù)后1周PHT對OPN吸光度值的影響Tab.3 Effect of PHT at week 1 after operation on OPN absorbency value（±s，n=15）

PHT+rPDLSCs與r PDLSCs組比較、PHT組與空白組比較，*P＜0.05；20μg/m L與40μg/m L和100μg/m L比較，△P＜0.05。

PHT PHT+rPDLSCs rPDLSCs PHT空白組20μg/m L 0.098 5±0.004 1△0.081 5±0.003 4 0.094 2±0.002 3△0.071 5±0.001 7 40μg/m L 0.151 4±0.011 9*0.071 5±0.039 8 0.126 4±0.021 9*0.060 8±0.001 3 100μg/m L 0.132 6±0.007 2*0.074 9±0.002 6 0.111 5±0.011 2*0.063 1±0.002 3

表4 術(shù)后2周PHT對OPN吸光度值的影響Tab.4 Effect of PHT at week 2 after operation on OPN absorbency value（±s，n=15）

表4 術(shù)后2周PHT對OPN吸光度值的影響Tab.4 Effect of PHT at week 2 after operation on OPN absorbency value（±s，n=15）

PHT+rPDLSCs與r PDLSCs組比較、PHT組與空白組比較，*P＜0.05；PHT+rPDLSCs與PHT組比較，#P＜0.05；20μg/m L與40μg/m L和100μg/m L比較，△P＜0.05。

PHT PHT+rPDLSCs rPDLSCs PHT 空白組20μg/m L 0.126 2±0.012 4△0.112 5±0.013 4 0.121 4±0.011 9△0.092 3±0.041 2 40μg/m L 0.208 1±0.016 9*#0.128 4±0.011 8 0.144 8±0.002 1*0.106 4±0.029 1 100μg/m L 0.186 6±0.033 1*#0.115 7±0.018 5 0.123 2±0.001 9*0.092 5±0.007 2

表5 術(shù)后4周PHT對OPN吸光度值的影響Tab.5 Effect of PHT at week 4 after operation on OPN absorbency value（±s，n=15）

表5 術(shù)后4周PHT對OPN吸光度值的影響Tab.5 Effect of PHT at week 4 after operation on OPN absorbency value（±s，n=15）

PHT PHT+rPDLSCs rPDLSCs PHT 空白組20μg/ mL 0.286 3±0.021 5 0.271 6±0.016 2 0.286 5±0.039 1 0.239 5±0.007 5 m L 0.279 5±0.041 9 0.289 2±0.021 9 0.291 9±0.016 2 0.280 2±0.031 9 40μg/m L 0.300 6±0.015 9 0.262 3±0.031 6 0.283 9±0.021 3 0.271 6±0.021 4 100μg/

表6 術(shù)后1周各組RUNX2吸光度值的比較Tab.6 Comparison of RUNX2 absorbance value at week 1 after operation（±s，n=15）

表6 術(shù)后1周各組RUNX2吸光度值的比較Tab.6 Comparison of RUNX2 absorbance value at week 1 after operation（±s，n=15）

PHT+rPDLSCs與r PDLSCs組比較、PHT組與空白組比較，*P＜0.05；20μg/m L與40μg/m L和100μg/mL比較，△P＜0.05。

PHT PHT+rPDLSCs rPDLSCs PHT空白組20μg/m L 0.111 4±0.002 4△0.114 5±0.003 4 0.115 6±0.012 1△0.092 6±0.003 9 0.092 3±0.004 1 40μg/m L 0.176 6±0.023 1*0.112 5±0.006 7 0.163 2±0.009 3*0.100 6±0.019 4 100μg/mL 0.166 2±0.022 1*0.105 9±0.025 3 0.159 2±0.002 1*

表7 術(shù)后2周各組RUNX2吸光度值的比較Tab.7 Comparison of RUNX2 absorbance value at week 2 after operation（±s，n=15）

表7 術(shù)后2周各組RUNX2吸光度值的比較Tab.7 Comparison of RUNX2 absorbance value at week 2 after operation（±s，n=15）

PHT+rPDLSCs與r PDLSCs組比較、PHT組與空白組比較，*P＜0.05；PHT+rPDLSCs與PHT比較，#P＜0.05；20μg/m L與40μg/m L和100μg/m L比較，△P＜0.05。

PHT PHT+rPDLSCs rPDLSCs PHT空白組20μg/m L 0.169 3±0.041 3△0.148 1±0.018 5 0.159 2±0.012 5△0.128 9±0.014 2 40μg/m L 0.231 6±0.061 3*#0.157 1±0.003 6 0.170 4±0.021 3*0.119 2±0.034 6 100μg/m L 0.225 1±0.031 4*#0.151 9±0.041 2 0.169 3±0.024 6*0.103 1±0.044 1

表8 術(shù)后4周各組RUNX2吸光度值的比較Tab.8 Comparison of RUNX2 absorbance value at week 4 after operation（±s，n=15）

表8 術(shù)后4周各組RUNX2吸光度值的比較Tab.8 Comparison of RUNX2 absorbance value at week 4 after operation（±s，n=15）

PHT PHT+rPDLSCs rPDLSCs PHT 空白組20μg/m L 0.143 9±0.010 5 0.110 6±0.001 9 0.141 9±0.007 1 0.110 9±0.004 1 40μg/m L 0.161 6±0.011 2 0.148 0±0.003 4 0.170 3±0.006 1 0.124 7±0.004 4 100μg/mL 0.150 3±0.023 9 0.143 0±0.014 5 0.151 9±0.036 7 0.100 9±0.015 2

3 討 論

臨床觀察以及實驗研究發(fā)現(xiàn)，苯妥英鈉可以刺激成纖維細胞的分裂活動，使合成蛋白質(zhì)和膠原的能力增強；由于合成大于降解，致使結(jié)締組織增生引起膠原沉積，最終導致牙齦增生的形成，而這種引起膠原沉積的作用對于牙周組織缺損的患者卻能起到有利的作用。

在本實驗中，我們將Brd U標記的r PDLSCs通過舌下靜脈注入下頜骨急性缺損的SD大鼠體內(nèi)，20 μg/m L PHT組遷移的Brd U細胞數(shù)明顯少于40 μg/m L和100μg/m L PHT組，提示40μg/m L和100μg/m L的PHT通過其旁分泌作用可以趨化更多移植的干細胞優(yōu)先遷移至缺損區(qū)域并進行增殖和分化。因此，認為40μg/m L和100μg/m L PHT可以趨化缺損附近的干細胞優(yōu)先遷移至缺損區(qū)域并積極地促進其增殖，進行牙周組織的修復。

骨缺損區(qū)域OPN表達的結(jié)果提示，40μg/m L和100μg/m L PHT可以促進移植的細胞和缺損區(qū)域附近的牙周膜干細胞首先到達缺損區(qū)域，促進其增殖并分化為成骨細胞，進而分泌成骨細胞的標志物OPN；4周時，各組內(nèi)及組間OPN的表達沒有統(tǒng)計學差異，可以認為此時骨基質(zhì)成熟、骨組織修復趨于完善，所以PHT對于OPN的表達量影響較小。RUNX2的表達量與OPN的趨勢基本一致，只是在4周時RUNX2的表達量較2周時減少，這主要是因為RUNX2是在成骨細胞分化早期表達的產(chǎn)物，而此時骨組織已經(jīng)趨于成熟，成骨細胞活性減弱，所以此時RUNX2的表達量降低。

可以認為，40μg/m L PHT和100μg/m L PHT對于牙周膜干細胞的遷移、增殖和成骨分化具有較強的促進作用，而適宜濃度的PHT在整個骨形成的早期階段具有明顯的促進作用，加速了骨組織的修復。

雖然本實驗證實了苯妥英鈉能夠趨化牙周膜干細胞優(yōu)先遷移至缺損區(qū)域并促進牙周組織的修復，但將苯妥英鈉與明膠海綿聯(lián)合應用時其藥物的緩釋時間尚不清楚，還需要進行一系列的藥理學研究，為苯妥英鈉與牙周膜干細胞共同應用于牙周病的治療提供理論與實驗依據(jù)。

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（編輯 卓選鵬）

Effects of phenytoin on migration and osteogenic differentiation of rPDLSCs

BA Xiao-ye1，HE Shan2，DING Ya-juan2，YANG Yi-ting2，WANG Bao-yan3
（1.Department of Oral Medicine，Xi'an Gaoxin Hospital，Xi'an 710000；2.Department of Oral Medicine，The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004；3.Department of Periodontal Membrane，School of Stomatology of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China）

Objective To explore the effects of local application of phenytoin（PHT）on the rat periodontal ligament stem migration and differentiation in vivo microenvironment.Methods We established a mandibular acute defect model in 54 SD male rats.The defect was treated with PHT of different concentrations.After surgery the experimental group

injection of 5-bromodeoxyuridine（Brd U）-labeled rat periodontal ligament stem cells（rPDLSCs）while the control group was injected with the same amount of PBS.The rats were sacrificed by 3 at 1 w，2 w and 4 w for HE staining and immunohistochemical staining of Brd U，OPN and RUNX2 using image Proplus image analysis and statistical analysis.Results PHT of 40μg/m L and 100μg/m L promoted the formation of bone on the surface of defects.Immunohistochemical staining showed that the number of Brd U staining on PHT side was greater than in the control group while RUNX2 and OPN expressions did not differ significantly in 40μg/m L and 100μg/m L PHT staining groups（P＞0.05）.Conclusion PHT of 40μg/m L and 100μg/m L can make periodontal ligament stem cells migrate to the defect area，proliferate or differentiate into osteoblasts，thus promoting healing of bone tissues.

periondontitis；periodontal ligament stem cell；phenytoin；migration；differentiation；OPN；RUNX2；Brd U

R784.1

A

10.7652/jdyxb201505014

2015-03-19

2015-04-13

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)資助項目（No.2012SE2-22）Supported by the Social Development Project of Science and Technology Department of Shaanxi Province（No.2012SE2-22）

王寶彥.E-mail：baoyan@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150817.0928.002.html（2015-08-17）