Fgl2-shRNA基因沉默對糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形態(tài)變化

俞芽法，鄭振中

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330006；2.江西省撫州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西撫州 344000）

Fgl2-shRNA基因沉默對糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形態(tài)變化

俞芽法1，2，鄭振中1

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330006；2.江西省撫州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西撫州 344000）

目的 探討慢病毒介導(dǎo)的纖維介素（fgl2）基因沉默對糖尿?。―M）大鼠心功能的影響及其在心肌組織中的表達(dá)。方法 雄性SD大鼠腹腔注射STZ建立DM模型，隨機(jī)分組為fgl2基因沉默組、GEP空載體組、DM模型組（DM組），基因沉默及GEP空載體組分別尾靜脈注射慢病毒載體1×109IU，DM組注射生理鹽水；另設(shè)對照組（各組8只）。14周后超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)（LVEE）、左室短軸縮短率（即縮短分?jǐn)?shù)，ES）、心率（HR）等，心肌組織進(jìn)行HE染色觀察病理形態(tài)及免疫組化染色檢測fgl2表達(dá)。結(jié)果 DM組大鼠LVEE、ES降低，HR減少；HE染色示心肌纖維排列紊亂、縱橫紋模糊、部分區(qū)域變性等；免疫組化fgl2染色示微血管內(nèi)及周圍大量棕黃色絮狀染色。fgl2基因沉默組LVEE、ES、HR較DM組提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為心肌纖維排列稍紊亂；免疫組化結(jié)果顯示微血管內(nèi)少量棕黃色絮狀染色，較DM組明顯減少，灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Egl2基因沉默下調(diào)DM大鼠心肌fgl2表達(dá)，改善病理形態(tài)，抑制心室重構(gòu)，保護(hù)心臟功能。

纖維介素（fgl2）；糖尿??；糖尿病心肌病；基因沉默；心室重構(gòu)

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康的主要慢性疾病之一。DM心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是其主要心血管并發(fā)癥，表現(xiàn)為舒張及收縮功能不全、心力衰竭等。纖維介素（fibrinogen-like protein 2，fgl2）蛋白屬于纖維蛋白原家族，由活化的巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，具有fgl2的活力，能催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，啟動(dòng)凝血過程［1］。近年的研究表明，fgl2與多種疾病有相關(guān)性［2］，可能參與DM心肌微循環(huán)中微血栓的形成。慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，其特點(diǎn)是對分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞均具有感染能力，其感染效力高并可在宿主體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)［3］。本研究通過RNA干擾特異性沉默fgl2基因，觀察1型DM大鼠模型心肌fgl2表達(dá)、心肌病理形態(tài)及心臟功能變化，探討DCM的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級雄性Sprague-Dawley SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司）；fgl2-ShRNA慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P公司包裝及測定病毒滴度；血糖儀及試紙（長沙三諾有限公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋）；免疫組化試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；多功能心臟彩色多普勒超聲儀（美國GE公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；HMIAS2000高清晰度醫(yī)學(xué)彩色圖文分析系統(tǒng)（武漢干屏）。

1.2 模型制備及分組模型制備參閱文獻(xiàn)［4］并進(jìn)行改進(jìn)，雄性SD大鼠40只，常規(guī)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分組。32只空腹給予檸檬酸緩沖液稀釋的STZ 60 mg/kg腹腔注射，第3天重復(fù)注射相同劑量，3 d及1周后測尾靜脈血糖，以空腹≥16.6 mmol/L為DM成模型標(biāo)準(zhǔn)。成模穩(wěn)定后2周，排除血糖不達(dá)標(biāo)大鼠，符合DM模型大鼠24只，隨機(jī)分為DM組、DM空載體組（GEP組）、fgl2基因沉默組（fgl2沉默組）；并設(shè)對照組（NC組），各組n=8。基因沉默及GEP組分別尾靜脈注射慢病毒載體1×109IU，DM組注射1 m L生理鹽水。各組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，室溫自然光照，通風(fēng)良好，自由飲水。

1.3 心臟超聲檢測心臟功能第14周末將所有大鼠進(jìn)行心臟彩超。每只大鼠空腹8 h后，腹腔注射100 g/L水合氯醛（350 mg/kg或0.3 mL/100 g）麻醉，仰臥位固定，剔去胸部毛發(fā)。使用GEvivid7彩色多譜勒超聲診斷儀，探頭選用10 s，采用12 MHZ高頻率探頭，在取胸骨旁左心室短軸二維超聲圖像后，通過M型超聲獲得舒張末及收縮末左心室內(nèi)徑，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEE）、左室短軸縮短率（即縮短分?jǐn)?shù)，left ventricular short axis reduced rate，ES）及心率（heart rate，HR）。

1.4 心臟指數(shù)及病理形態(tài)學(xué)觀察大鼠處死前稱重，取出心臟后去除多余組織并用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，計(jì)算心臟質(zhì)量與大鼠質(zhì)量比值為心臟指數(shù)（mg/g）。

取左心室心肌，常規(guī)中性甲醛固定、石蠟包埋、切片，脫蠟至水，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 免疫組化檢測心肌fgl2表達(dá)按照免疫組織化學(xué)染色二步法試劑盒說明書操作。心肌組織石蠟切片脫蠟至水，PBS配制新鮮的30 m L/L H2O2室溫封閉，微波爐修復(fù)抗原，滴加1∶50稀釋的一抗fgl2，置濕盒37℃孵育2 h，滴加生物素化二抗，37℃30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染色1 min，PBS沖洗返藍(lán)；碳酸鋰浸2 s，脫水、脫乙醇、室溫風(fēng)干、中性樹脂封片。采用HMIAS2000高清晰度醫(yī)學(xué)彩色圖文分析系統(tǒng)，應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行判讀，陽性表達(dá)為棕黃色或棕褐色，陽性表達(dá)部位在微血管周圍，染色明顯高于背景。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野（×400）攝片，觀察并計(jì)算灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較在滿足正態(tài)性和方差齊性的條件下，采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對因素t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血糖測定結(jié)果采用連續(xù)2次腹腔注射STZ法，32只大鼠有3只血糖未達(dá)標(biāo)，成功率90.6%。選取符合標(biāo)準(zhǔn)的DM大鼠24只隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。各模型組大鼠血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分別為DM組（23.08±4.05）mmo/L，GEP組（19.91±3.56）mmol/L，fgl2沉默組（21.60± 3.63）mmol/L，均比NC組的（4.94±0.57）mmol/L明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 心臟超聲檢測心功能及心臟指數(shù)DM組、GEP組的LVEE、ES較NC組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HR降低，心臟指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DM組與GEP組的LVEE、ES、HR、心臟指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常組比較，fgl2沉默組LVEE、ES降低而心臟指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；fgl2沉默組與DM組及GEP組比較，LVEE、ES、HR及心臟指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠心功能和心臟指數(shù)的變化Tab.1 The changes of cardiac function and cardiac index of rats（±s，n=8）

表1 各組大鼠心功能和心臟指數(shù)的變化Tab.1 The changes of cardiac function and cardiac index of rats（±s，n=8）

與NC組比較，#P＜0.05，##P＜0.001；與fgl2沉默組比較，*P＜0.05。

組別LVEE（%）ES（%）HR（次/min）心臟指數(shù)（mg/g）81.99±1.763 45.56±3.351 294.33±16.99 2.668±0.949 DM組66.16±2.316#*33.50±0.836#*211.66±31.88##*3.536±0.535##*GEP組67.50±2.509#*31.20±4.543#*206.66±24.22##*3.813±0.169#*Egl2沉默組75.83±4.708#39.50±3.834#245.00±28.80##3.157±0.799 NC組#

2.3 各組心肌病理切片HE染色NC組光鏡下心肌細(xì)胞心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；DM組及GEP組心肌纖維排列紊亂、心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞核大小不甚規(guī)則、心肌細(xì)胞存在不同程度的變性；心肌纖維混濁、縱橫紋模糊、部分區(qū)域出現(xiàn)局灶性壞死，同時(shí)伴有不同程度的凝固性壞死；fgl2沉默組心肌病理形態(tài)稍有改變，表現(xiàn)為心肌纖維排列稍紊亂，但與DM組及GEP組比較，無明顯心肌纖維混濁、變性、壞死等（圖1）。

圖1 各組心肌組織的HE染色Eig.1 The pathological changes of heart tissue by HE staining（×200）

2.4 各組fgl2免疫組化染色結(jié)果fgl2免疫組化陽性染色為黃色及棕黃色絮狀染色。DM組及GEP組明顯高表達(dá)，表達(dá)部位為血管、微血管等內(nèi)皮細(xì)胞棕黃色絮狀染色，及心肌細(xì)胞細(xì)胞核黃色及棕黃色特異性染色；NC組血管及微血管處未見明顯絮狀特異性染色，心肌細(xì)胞細(xì)胞核極少量棕黃色染色；fgl2沉默組可見血管、微血管內(nèi)及周圍少量表達(dá)。DM組（157.60± 17.52）及GEP組（159.80±2.77）與正常組（182.20 ±5.26）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），fgl2沉默組（178.20±2.28）與DM組及GEP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組fgl2免疫組化染色結(jié)果Eig.2 The immunohistochemical staining of fgl2 in each group（×400）

3 討 論

DCM的概念已得到公認(rèn)，糖尿病被視為心血管疾病發(fā)病和死亡的主要獨(dú)立性危險(xiǎn)因子［5-6］。DCM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［7］，如高血糖、高血脂所致心肌代謝紊亂、微血管病變、心肌纖維化及心臟自主神經(jīng)功能紊亂等所致的心肌結(jié)構(gòu)異常，可引起左心室肥厚、舒張期和（或）收縮期功能障礙，最終心律失常、心力衰竭等。fgl2屬纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族，主要由活化的巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。早期研究發(fā)現(xiàn)參與暴發(fā)性肝炎、自發(fā)性流產(chǎn)、同種和異種急性移植排斥反應(yīng)等［8-10］。與經(jīng)典凝血途徑不同，它可直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變成有活性的凝血酶而促凝血，LEVY等［11］將fgl2促凝途徑稱為“免疫凝血”。近來研究發(fā)現(xiàn)fgl2受多種細(xì)胞因子調(diào)控，具有促凝血和促炎癥的雙重作用，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)T2DM組大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見fgl2高表達(dá)，且表達(dá)量與微血栓的陽性血管數(shù)正相關(guān)［2］。由此推斷，fgl2凝血酶原酶可能參與DM心肌微循環(huán)中微血栓的形成，進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙而促進(jìn)DM的微血管病變的發(fā)生和發(fā)展。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，因其對分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞均具有感染能力（如神經(jīng)細(xì)胞），不易誘發(fā)免疫反應(yīng)，感染效力高，并可在宿主體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)［3］。前期，我們構(gòu)建了fgl2-sh RNA慢病毒基因載體［12-13］，在大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)fgl2基因沉默促進(jìn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞MMVECs的增殖、遷移［14-15］。DM微血管病主要表現(xiàn)基底膜增厚、血栓形成、心肌細(xì)胞變性、心肌纖維化等，而針對特異性沉默fgl2基因是否改善DM心臟微血管病的發(fā)生、發(fā)展。本研究采用尾靜脈注射法建立慢病毒介導(dǎo)的fgl2-sh RNA基因沉默DM大鼠模型，采用超聲檢測DM大鼠心功能，發(fā)現(xiàn)DM大鼠心臟LVEE、LVSE、HR明顯降低；fgl2基因沉默組大鼠心臟LVEE、LVSE、HR等較DM組明顯改善。雖然基因沉默組DM大鼠體質(zhì)量及癥狀無明顯改善，但檢測各組大鼠心臟指數(shù)，結(jié)果顯示DM大鼠心臟指數(shù)增加，fgl2基因沉默組大鼠心臟指數(shù)減低，心肌肥厚及心臟功能改善。心肌代謝紊亂、細(xì)胞壞死及心肌細(xì)胞纖維化是DCM特征性病理表現(xiàn)。本研究大鼠心肌病理切片的觀察發(fā)現(xiàn)，fgl2基因沉默組表現(xiàn)為心肌纖維排列稍紊亂，但無明顯心肌纖維混濁、變性、壞死等，較DM組心肌細(xì)胞病理形態(tài)明顯改善。

通過fgl2免疫組化染色顯示，DM大鼠心肌微血管內(nèi)、周圍及心肌細(xì)胞核大量棕黃色絮狀物及棕黃染，正常組無明顯黃染；fgl2-shRNA基因沉默組微血管內(nèi)可見少量黃色及少量絮狀染色，心肌細(xì)胞細(xì)胞核極少量棕黃異性染色。根據(jù)DM大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及周圍fgl2高表達(dá)，說明fgl2參與微血管內(nèi)微血栓形成；fgl2-shRNA基因沉默下調(diào)fgl2表達(dá)，降低微血管內(nèi)血栓形成和心肌細(xì)胞變性壞死，抑制心室重構(gòu)等。同時(shí)提示基因沉默模型成功建立。

總之，fgl2可能參與DCM微血管病的發(fā)生發(fā)展，fgl2基因沉默下調(diào)其表達(dá)，改善心肌細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)，抑制心室重構(gòu)，保護(hù)心臟功能。

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（編輯 國 榮）

Effects of Fgl2 gene silencing on cardiac function and myocardial pathologic morphology in diabetic rats

YU Ya-fa1，2，ZHENG Zhen-zhong1
（1.Department of Cardiology，the Eirst Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006；2.Department of Cardiology，the Eirst People's Hospital of Euzhou City，Euzhou 344000，China）

Objective To investigate the effects of fibrinogen-like protein 2（fgl2）gene silencing mediated by lentivirus on cardiac function in diabetes mellitus（DM）rats and its expression in myocardial tissue.Methods Adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and model group.Streptozotocin（STZ）was injected intraperitoneally in model group.Diabetes rats were randomly divided into①fgl2-LV RNAi group（n =8）fgl2 lentivirus vector 1×109IU/n，injected by tail vein rapidly，②GFP-lentivirus sh-RNAi group（n=8），GFP-lentivirus sh-RNAi 1×109IU/n injected rapidly by tail vein；③diabetes group，saline solution injected by tail vein.Cardiac functions of the rats including left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular short axis reduced rate（FS），and heart rate（HR）were tested by ultrasonic method after 14 weeks.Myocardial tissue was fixed by formaldehyde for pathological slices.The pathological morphology was observed by HE staining and the expression of fgl2 was detected by immunohistochemical method.Results The cardiac functions of DM rats were impaired.LVEF，F(xiàn)S and HR were reduced；the arrangement of myocardial fibers was disordered；myocardial fibers were blurry with degeneration in some regions.A lot of brownish yellow flocculent staining of fgl2 could be observed in and around myocardial microvessels in diabetic group.LVEF，F(xiàn)S and HR increased significantly in fgl2 sh RNAi group compared with DM group（P＜0.05）.The arrangement of myocardial fibers was disorderly，and a small amount of brownish yellow flocculent dyeing within microvessels was shown byimmunohistochemical method.Thegray value decreased significantly compared with that in DM group（P＜0.05）.Conclusion Fgl2 gene silencing may downregulate the expression fgl2 in the myocardium of DM rats，improve pathologic morphology，and inhibit ventricular remodeling，thus protecting heart function.

fibrinogen-like protein 2（fgl2）；diabetes mellitus；diabetic cardiomyopathy；gene silencing；diabetes mellitus；ventricular remodeling

R587.1

A

10.7652/jdyxb201505006

2014-05-27

2015-04-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81260044；30960119）；江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010BSA12000）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81260044，30960119）and Science Support Project of Jiangxi Province（No.2010BSA12000）

鄭振中.E-mail：grteful@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150814.1554.002.html（2015-08-14）