過敏性哮喘對小鼠動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展及穩(wěn)定性的影響

王麗君，馬 利，郜珊珊，周 娟，袁祖貽

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710061；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西延安 716000）

過敏性哮喘對小鼠動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展及穩(wěn)定性的影響

王麗君1，馬 利2，郜珊珊1，周 娟1，袁祖貽1

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710061；2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西延安 716000）

目的 觀察過敏性哮喘對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化（AS）病變發(fā)生及發(fā)展不同時期的影響。方法 取6周齡的apoE-/-小鼠，以卵清蛋白（OVA）致敏后給予霧化吸入，激發(fā)哮喘發(fā)作以建立過敏性哮喘模型，激發(fā)2周后檢測小鼠肺部病理改變判斷造模是否成功。造模成功后分別于激發(fā)2周、4周、8周及16周時處死小鼠，取主動脈根部進(jìn)行冰凍切片，油紅O染色并計算AS斑塊相對面積，CD68熒光染色檢測斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量，天狼星紅染色檢測斑塊內(nèi)膠原含量。結(jié)果 與對照組相比，過敏性哮喘apoE-/-小鼠主動脈根部在激發(fā)2周時就有明顯的斑塊形成和巨噬細(xì)胞浸潤，并且隨著激發(fā)時間的延長，斑塊面積和斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量始終高于對照組，同時斑塊內(nèi)膠原含量下降。結(jié)論 過敏性哮喘促進(jìn)apoE-/-小鼠AS斑塊的形成和發(fā)展，并導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低。

過敏性哮喘；apoE-/-小鼠；動脈粥樣硬化；斑塊面積；斑塊穩(wěn)定性

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以Th1反應(yīng)為主導(dǎo)的慢性炎癥［1-2］，而過敏性哮喘（allergic asthma）則是以Th2反應(yīng)為主導(dǎo)的慢性炎癥［3］，二者代表CD4+T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的不同方向，但目前對二者之間的具體關(guān)系尚未有定論。臨床流行病學(xué)資料顯示，過敏性哮喘是冠心病和中風(fēng)的顯著危險因素［4-6］，對女性尤其明顯［5］；而另外一些研究則顯示，過敏性哮喘是成人中風(fēng)的獨(dú)立危險因素，但與冠心病無關(guān)［7］；還有研究顯示過敏性哮喘對肥胖引起的AS有保護(hù)作用［8］。這些結(jié)果提示合并過敏性哮喘對AS病變發(fā)生發(fā)展的影響仍未完全明了。本研究擬在過敏性哮喘AS動物模型（過敏性哮喘apoE-/-小鼠）基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察在病變發(fā)生及發(fā)展不同時期其主動脈AS病變面積和穩(wěn)定性的改變，以期明確過敏性哮喘對AS的作用，為進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料C57BL/6J背景的apoE-/-小鼠，本實(shí)驗(yàn)室已有維持品系，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，出生后4周離乳，給予SPE級普通飼料喂養(yǎng)。造模用的卵清蛋白（ovalbumin，OVA）及氫氧化鋁均購自Sigma公司，油紅O染料購自Amresco公司，天狼星紅染料和EITC標(biāo)記的α-actin單克隆抗體購自Sigma公司。大鼠抗小鼠CD68抗體購自Ab Dserotec公司。Leico恒冷切片機(jī)、Olympus BX51正置熒光顯微鏡來自西安交通大學(xué)心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室。

1.2 動物模型的制備和評價取6周齡apoE-/-小鼠，在SE-WOONG等［9］的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，分別于第0、7、14天給予腹腔注射OVA+氫氧化鋁佐劑進(jìn)行致敏（每只0.2 m L，含OVA 500μg/m L），并于第14天開始以10 g/L OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)哮喘發(fā)作，每周3次，每次30 min，對照組給予PBS霧化吸入。

所有小鼠分為哮喘組和對照組2個大組，每個大組根據(jù)激發(fā)持續(xù)時間不同分為激發(fā)2周（急性）、4周（亞急性）、8周（慢性）和16周（持續(xù)慢性），共8個組，每組6只。于激發(fā)2周后，取對照組和哮喘組各2只處死，并取小鼠左肺進(jìn)行HE染色檢測肺部病理炎癥浸潤情況，以判斷造模是否成功。

1.3 標(biāo)本采集分別于激發(fā)2、4、8、16周處死小鼠（末次激發(fā)后24 h處死），眼球采血后快速開胸并充分暴露心臟，生理鹽水心臟灌流沖凈血管及組織中的殘留血液，分離并取下主動脈根部，40 g/L多聚甲醛固定1 h，250 g/L蔗糖脫水至組織沉底。濾紙吸干多余水分，OCT復(fù)合物包埋儲存于—80℃冰箱直至切片。

1.4 主動脈根部斑塊面積的分析OCT包埋的主動脈根部做冰凍切片，從主動脈根部開始連續(xù)橫切，以見到3個主動脈瓣為標(biāo)志，連續(xù)收集7μm厚的系列冰凍切片共400μm長，每張玻片8個切片?！?0℃冰箱保存切片。

油紅O染色檢測主動脈根部的脂質(zhì)，以斑塊面積占管腔橫截面積的百分比表示病變面積的相對大小。使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡采集圖像，并用IPP6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1

.5 主動脈根部斑塊成分的檢測取主動脈根部冰凍切片，用抗CD68抗體（1∶200）進(jìn)行免疫熒光染色檢測斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞含量，天狼星紅染色檢測斑塊內(nèi)的膠原含量，以陽性面積占斑塊面積的百分比表示斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞和膠原含量。使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡采集圖像，并用IPP6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組數(shù)據(jù)間的差異用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物模型評價哮喘組小鼠在激發(fā)過程中出現(xiàn)明顯呼吸加深加快、煩躁不安或者匍匐少動，弓背直立，并有抓耳騷鼻和二便失禁等哮喘急性發(fā)作表現(xiàn)。肺組織切片HE染色顯示小支氣管及伴行小血管旁大量炎性細(xì)胞浸潤，小支氣管內(nèi)黏膜皺壁消失，平滑肌染色可見氣道下平滑肌有損傷及斷裂，天狼星紅染色可見氣道下有膠原沉積。支氣管灌洗液嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目增加（圖1）。上述結(jié)果證明模型制備成功。

2.2 過敏性哮喘對apoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊面積的影響油紅O染色檢測apoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘組apoE-/-小鼠主動脈根部切片2周組（急性）即有明顯斑塊出現(xiàn)，而此時對照組并無顯著斑塊形成。隨激發(fā)時間的延長斑塊面積逐漸增加。與對照組相比，從急性期到慢性期各個時期的哮喘組小鼠斑塊面積均明顯增加（P＜0.05，圖2）。

2.3 過敏性哮喘對apoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊內(nèi)成分的影響用免疫熒光染色檢測apoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68表示巨噬細(xì)胞含量。與對照組相比，從激發(fā)2周開始，哮喘組小鼠的斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量就有顯著增加（P＜0.05），并且隨著激發(fā)時間的延長，哮喘組小鼠斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞含量始終高于對照組（P＜0.05，圖3）。此外天狼星紅染色提示哮喘組小鼠斑塊內(nèi)膠原含量在激發(fā)8周和16周的時候較對照組顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖1 過敏性哮喘apoE-/-小鼠模型肺部的病理改變Eig.1 Pathological changes in the lung of apoE-/-mice（×100）

圖2 過敏性哮喘與對照apoE-/-小鼠主動脈根部AS病變內(nèi)油紅O染色Eig.2 Oil red staining of aortic root AS lesion in asthma and control apo E-/-mice（×100）

3 討 論

AS和過敏性哮喘都是慢性炎癥性疾病，多種炎癥細(xì)胞和炎性因子參與其中，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和肥大細(xì)胞等［10］。CD4+T細(xì)胞在其中發(fā)揮著重要作用，Th1/Th2陰陽平衡的失衡被認(rèn)為是AS和過敏性哮喘發(fā)病的重要機(jī)制：Th1/Th2失衡，Th1過度增殖是AS的發(fā)病機(jī)制［11］；而Th2細(xì)胞增多則被認(rèn)為是過敏性哮喘的重要發(fā)病機(jī)制［3］。臨床流行病學(xué)資料中一些研究認(rèn)為過敏性哮喘是冠心病和中風(fēng)的顯著危險因素［4-6］；而另外一些研究則顯示過敏性哮喘與冠心病無關(guān)［7］。還有研究則顯示過敏性哮喘對肥胖引起的AS有保護(hù)作用［8］。本研究采用OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘AS動物模型（過敏性哮喘apoE-/-小鼠）并觀察了其主動脈AS病變面積和穩(wěn)定性在病變發(fā)生發(fā)展不同時期的改變。

圖3 過敏性哮喘與對照apoE-/-小鼠主動脈根部AS病變內(nèi)巨噬細(xì)胞染色Eig.3 Macrophage staining of aortic root AS lesion in asthma and control apo E-/-mice（×200）

圖4 過敏性哮喘與對照apoE-/-小鼠主動脈根部AS病變內(nèi)膠原染色Eig.4 Collagen staining of aortic root AS lesion in asthma and control apoE-/-mice（×200）

本研究對小鼠主動脈根部斑塊進(jìn)行油紅O染色，發(fā)現(xiàn)在哮喘激發(fā)2周時，哮喘組apoE-/-小鼠主動脈根部就有明顯的斑塊出現(xiàn)，而此時對照組尚未有顯著斑塊生成，提示過敏性哮喘對AS發(fā)生的早期發(fā)生即有促進(jìn)作用。而隨著激發(fā)時間的延長，哮喘組小鼠主動脈根部斑塊面積始終大于對照組，提示過敏性哮喘不僅對AS發(fā)生的早期發(fā)生有促進(jìn)作用，而且對其進(jìn)展期依然有明顯的作用。

巨噬細(xì)胞是一種重要的炎癥細(xì)胞，AS斑塊的起始、發(fā)生和發(fā)展均離不開巨噬細(xì)胞的參與，其所分泌的各種炎性因子影響著AS斑塊的轉(zhuǎn)歸。因此，主動脈根部AS斑塊中巨噬細(xì)胞的含量多少被認(rèn)為是判斷斑塊穩(wěn)定性的一個重要指標(biāo)，巨噬細(xì)胞含量多則說明炎癥浸潤較多，斑塊趨向于不穩(wěn)定，相反則趨向于穩(wěn)定［12-15］。而斑塊內(nèi)的膠原含量則是另一個影響斑塊穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，膠原含量少則斑塊趨向于不穩(wěn)定，相反則趨向于穩(wěn)定［12-13］。本研究用免疫熒光染色法觀察了不同時期小鼠主動脈根部斑塊中CD68含量，在OVA激發(fā)哮喘2周后，哮喘組apoE-/-小鼠主動脈根部就有明顯的巨噬細(xì)胞浸潤，而對照組則幾乎未觀察到，提示過敏性哮喘對AS早期的炎癥浸潤有顯著促進(jìn)作用；隨著激發(fā)時間的延長，哮喘組小鼠主動脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞含量始終高于對照組，并且斑塊內(nèi)的膠原含量也較對照組顯著減少。這提示過敏性哮喘不僅對AS斑塊面積增長有促進(jìn)作用，還影響了進(jìn)展期斑塊的穩(wěn)定性，使其變得更加不穩(wěn)定。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)小鼠激發(fā)16周的主動脈根部斑塊中的巨噬細(xì)胞含量較前有所減少，分析其由于AS的病變發(fā)生發(fā)展早期是以炎性浸潤為主，晚期則是以纖維修復(fù)為主，而在OVA激發(fā)16周時，小鼠已經(jīng)是24周齡，此時斑塊已進(jìn)展為纖維斑塊，因此巨噬細(xì)胞的浸潤較早期相對減少。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘可以顯著增加apoE-/-小鼠主動脈根部斑塊的面積，并且導(dǎo)致其斑塊巨噬細(xì)胞含量增加、膠原減少、穩(wěn)定性下降，且此作用貫穿斑塊發(fā)生發(fā)展各個時期，為過敏性哮喘作為AS的危險因素增添了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為進(jìn)一步研究其具體機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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（編輯 國 榮）

Effect of allergic asthma on the development of atherosclerosis in mice

WANG Li-jun1，MA Li2，GAO Shan-shan1，ZHOU Juan1，YUAN Zu-yi1
（1.Department of Cardiology，the Eirst Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061；2.Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Yan'an University，Yan'an 716000，China）

Objective To investigate the effect of allergic asthma on the pathogenesis and development of atherosclerosis（AS）in apoE-/-mice.Methods Six-week apoE-/-mice were used in the experiment.Allergic asthma model was established by ovalbumin（OVA）sensitization and challenge.After asthma was induced，the model was assessed by lung histopathology and eosinophils counts of BALF.Mice were challenged for 2，4，8 or 16 weeks.Frozen sections of aortic root were examined for AS lesion：the area of lesion by oil red staining，the collagen content by Sirius red staining and the macrophage infiltration by CD68 immunofluorescence staining，respectively.Results The results showed that the allergic asthma mice models were successfully established.The area of aortic root plaque was significantly increased in asthmatic apoE-/-mice compared with that in the control group.Meanwhile，macrophage infiltration was increased but the collagen content was decreased in plaque of asthmatic apoE-/-mice compared with control group.Conclusion Allergic asthma accelerates the formation and development of AS and decreases the stability of plaques in the apo E-/-mice.

allergic asthma；apoE-/-mouse，atherosclerosis；area of lesion；stability of plaque

R541.4

A

10.7652/jdyxb201505005

2014-12-14

2015-03-18

國家自然科學(xué)基金杰出青年基金資助項目（No.81025002）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973計劃”，No.2012CB517804）Supported by the National Natural Science Eoundation for Distinguished Young Scholars（No.81025002）and the National Key Basic Research Program of China（“973 Project”，No.2012CB517804）

袁祖貽.E-mail：zuyiyuan@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150720.1654.012.html（2015-07-20）