IGF-Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC97-H癌基因C-myc和N-ras表達的影響

姬媛媛，王志東，楊正安，王寶太，史 敏，惠 博，雷妮娜，岳衛(wèi)娜

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.科研中心實驗室；2.干四病區(qū)普通外科，陜西西安 710004）

IGF-Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC97-H癌基因C-myc和N-ras表達的影響

姬媛媛1，王志東2，楊正安2，王寶太2，史 敏2，惠 博2，雷妮娜2，岳衛(wèi)娜2

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.科研中心實驗室；2.干四病區(qū)普通外科，陜西西安 710004）

目的 觀察胰島素樣生長因子Ⅱ（IGE-Ⅱ）對肝癌細(xì)胞MHCC97-H中癌基因C-myc和N-ras表達的影響。方法 培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株MHCC97-H，用IGE-Ⅱ（50 ng/m L）作用48 h后，分別采用細(xì)胞免疫熒光、Western blot法及Real-time PCR法檢測細(xì)胞中C-myc和N-ras的表達情況，并與對照組比較，進行定量分析。結(jié)果 C-myc及N-ras蛋白陽性表達主要位于細(xì)胞核。對照組、IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc熒光表達量分別為（100.00±2.89）%、（254.00±35.57）%，N-ras熒光表達量分別為（100.00±14.43）%、（257.30±22.43）%。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc及N-ras蛋白表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc和N-ras的mRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 IGE-Ⅱ可上調(diào)肝癌細(xì)胞MHCC97-H中癌基因C-myc和N-ras的蛋白及mRNA表達，這可能是IGE-Ⅱ促進肝癌細(xì)胞增殖的分子機制之一，這為臨床上肝癌防治提供了新線索。

胰島素樣生長因子Ⅱ（IGE-Ⅱ）；肝癌；增殖；C-myc；N-ras

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，具有易侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等特點。肝癌的高侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良及臨床療效不佳的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。細(xì)胞生長增殖是肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的始動因素，在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中居于要位［2］。癌基因的突變可致其功能異常活化，通過促使細(xì)胞持續(xù)生長增殖，繼而誘導(dǎo)大量肝細(xì)胞癌變［3］。胰島素樣生長因子Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ，IGE-Ⅱ）作為一種增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞分化、增殖、胚胎的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的促進作用［4］。前期研究已證實，IGE-Ⅱ具有刺激肝癌細(xì)胞生長增殖的功能，然而，IGE-Ⅱ與癌基因表達之間的關(guān)系目前尚不清楚。因此，本實驗以IGE-Ⅱ作用于人肝癌細(xì)胞MHCC97-H，觀察其對肝癌細(xì)胞MHCC97-H中癌基因（C-myc及N-ras）表達的影響，進一步明確IGE-Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的作用機制，以期為臨床上肝癌的防治提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供；胎牛血清（EBS）和DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；IGE-Ⅱ購自美國Sigma公司；RIPA裂解液來自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑（Cocktail）購自美國Roche公司；NC膜購自美國Millipore公司；化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自美國Pierce公司；兔抗人β-actin抗體購自美國Proteintech公司，兔抗人C-myc和N-ras抗體購自美國Abcam公司，羊抗兔IgG-HRP抗體由陜西先鋒生物科技有限公司提供；總RNA提取試劑盒購自陜西先鋒生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMPerfect Real Time試劑盒購自TaKaRa寶生物工程有限公司，熒光實時定量PCR儀型號為美國Applied Biosystems StepOne；C-myc、N-ras及β-actin引物由TaKaRa寶生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H接種在DMEM高糖完全培養(yǎng)基（100 m L/L EBS、100萬U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素）中，培養(yǎng)于37℃、50 m L/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d進行1次傳代，選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞免疫熒光法MHCC97-H細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入含5 m L/L EBS的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h同步化后，予以IGE-Ⅱ（50 ng/m L）作用48 h，對照組加入無血清的DMEM培養(yǎng)基。采用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測MHCC97-H細(xì)胞中C-myc、N-ras的表達，簡要步驟如下：細(xì)胞爬片經(jīng)40 g/L多聚甲醛溶液固定，即用2.5 mL/L Triton X-100室溫10 min，PBS沖洗5×3 min，正常山羊血清室溫下封閉30 min，兔抗人一抗C-myc（1∶250）及N-ras（1∶50）4℃孵育過夜，PBS沖洗5×3 min，EITC標(biāo)記羊抗兔二抗避光常溫孵育2 h，最后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。用甘油封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，且對熒光染色結(jié)果進行定量分析。

1.4 Western blot檢測蛋白表達IGE-Ⅱ（50 ng/mL）刺激MHCC97-H細(xì)胞48 h后，棄去培養(yǎng)液，冷PBS輕輕漂洗后，加入細(xì)胞冷裂解液，刮下裂解細(xì)胞置于2 m L Eppedorf管中，經(jīng)細(xì)胞膜破碎儀反復(fù)抽打細(xì)胞3次后，靜置于冰上20 min，12 000 r/min、4℃離心15 min，將上清待測蛋白樣品于—20℃冰箱內(nèi)保存。實驗組、對照組的蛋白定量按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行操作。

Western blot檢測簡要步驟如下：待測樣品蛋白20μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE（50 g/L濃縮膠及100 g/L分離膠）電泳，半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。50 g/L脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入一抗（兔抗人C-myc 1∶10 000，兔抗人N-ras 1∶500，兔抗人內(nèi)參β-actin 1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST沖洗15 min× 4，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h，TBST沖洗15 min×4，立即用ECL顯色，利用凝膠圖像分析系統(tǒng)曝光蛋白條帶，對圖像進行拍照和定量分析。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。結(jié)果表示為：IGE-Ⅱ組蛋白表達量/正常對照組蛋白表達量。

1.5 Real-time PCR檢測mRNA表達按照試劑盒說明操作提取總RNA，使用紫外分光光度計進行RNA濃度及純度測定，—80℃冰箱保存。將2μg提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL進行Realtime PCR循環(huán)擴增。其中目的基因C-myc的引物序列為：上游5＇-GCAGCTGCTTAGACGCTGGA-3＇，下游5＇-CGCAGTAGAAATACGGCTGCAC-3＇，擴增片段為136 bp；目的基因N-ras引物序列為：上游5＇-GCACTGACAATCCAGCTAATCCA-3＇，下游5＇-GTCCAACAAACAGGTTTCACCATC-3＇，擴增片段為111 bp；β-actin內(nèi)參的引物序列為：上游5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，下游5＇-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3＇，擴增片段為186 bp。Real-time PCR擴增程序為：預(yù)變性：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，每組設(shè)3個復(fù)孔，每個樣本做3個復(fù)管。使用ABI Real-time PCR擴增儀器中的軟件求出各樣本的Ct值，用2-△△Ct法計算出實驗組基因表達與正常對照組基因表達比較的Eolds值。此外，取PCR產(chǎn)物8μL上樣于15 g/L瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），85 V電泳25 min，利用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描并拍攝圖片。結(jié)果表示為：IGE-Ⅱ組mRNA表達量/正常對照組m RNA表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以±s表示，用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)首先進行了正態(tài)性分布和方差齊性檢查，然后組間兩兩比較采用Student's t檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IGF-Ⅱ明顯增加MHCC97-H細(xì)胞中C-myc的熒光表達共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，IGE-Ⅱ（50 ng/m L）作用于MHCC97-H細(xì)胞48 h后，C-myc陽性染色為綠色，主要定位于細(xì)胞核，其在細(xì)胞質(zhì)中未見表達，而DAPI將細(xì)胞核染為藍色，綠色和藍色可以完全重合，進而說明C-myc在細(xì)胞核表達。對照組、IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc熒光表達量分別為（100.00±2.89）%、（254.00±35.57）%。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc熒光表達量明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.042，圖1）。

2.2 IGF-Ⅱ明顯增加MHCC97-H細(xì)胞中N-ras熒光表達共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，IGE-Ⅱ（50 ng/m L）作用于MHCC97-H細(xì)胞48 h后，N-ras陽性染色為綠色，主要定位于細(xì)胞核，其在細(xì)胞質(zhì)中未見表達，而DAPI將細(xì)胞核染為藍色，綠色和藍色可以完全重合，進而說明N-ras在細(xì)胞核表達。對照組、IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中N-ras熒光表達量分別為（100.00±14.43）%、（257.30±22.43）%。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中N-ras熒光表達量明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.043，圖2）。

2.3 IGF-Ⅱ上調(diào)MHCC97-H細(xì)胞中C-myc和N-ras蛋白表達Western blot檢測對照組、IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc蛋白相對表達量分別為1.00 ±0.00、3.45±0.50；N-ras蛋白相對表達量分別為1.00 ±0.00、2.93±0.24。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc和N-ras蛋白表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.039、P=0.016，圖3）。

圖2 共聚焦顯微鏡觀察IGF-Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC97-H中N-ras的熒光表達Eig.2 IGE-Ⅱsignificantly enhanced the immunofluorescent expression of N-ras in MHCC97-H cells

圖3 Western blot檢測肝癌細(xì)胞MHCC97-H中C-myc和N-ras蛋白表達Eig.3 Expressions of C-myc and N-ras in MHCC97-H cells detected by Western blot

2.4 IGF-Ⅱ上調(diào)MHCC97-H細(xì)胞中C-myc mRNA水平Real-time PCR檢測對照組、IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、3.98±0.34。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中C-myc mRNA表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.013，圖4）。

2.5 IGF-Ⅱ上調(diào)MHCC97-H細(xì)胞中N-ras mRNA水平Real-time PCR檢測對照組、IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中N-ras m RNA相對表達量分別為1.00±0.00、3.16±0.34。與對照組相比，IGE-Ⅱ組MHCC97-H細(xì)胞中N-ras mRNA表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024，圖5）。

3 討 論

圖4 Real-time PCR檢測IGF-Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC97-H中C-myc mRNA表達變化Eig.4 IGE-Ⅱupregulated the mRNA expression of C-myc in MHCC97-H cells

圖5 Real-time PCR檢測IGF-Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC97-H中N-ras mRNA的表達變化Eig.5 IGE-Ⅱupregulated the m RNA expression of N-ras in MHCC97-H cells

目前研究認(rèn)為，癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是一個由細(xì)胞外多種促生長因子激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨?，使得癌細(xì)胞內(nèi)多種癌基因或者抑癌基因表達異常，繼而促進癌細(xì)胞異常增殖的多步驟、多階段的復(fù)雜過程。癌基因在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著重要作用，而癌基因突變被認(rèn)為是肝癌細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)［5］。常見的腫瘤癌基因有轉(zhuǎn)化基因（N-ras）、增殖相關(guān)基因（C-myc）等。其中轉(zhuǎn)化基因N-ras被認(rèn)為是肝癌中最早發(fā)現(xiàn)的惡性轉(zhuǎn)化基因，其可以導(dǎo)致肝細(xì)胞不斷生長增殖而使細(xì)胞最終發(fā)生癌變［5］。新近研究發(fā)現(xiàn)，增殖相關(guān)基因C-myc的活化與大量肝細(xì)胞的癌變關(guān)系密切，并且其還直接參與誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌前病變過程的形成［6］。

目前認(rèn)為，生長因子IGE-Ⅱ在肝細(xì)胞的癌變過程中亦發(fā)揮重要作用，在轉(zhuǎn)基因鼠、化學(xué)誘癌鼠等動物模型以及肝炎病毒慢性感染的肝組織中獲得證實［7］。此外，我們前期實驗研究也發(fā)現(xiàn)，不同濃度的IGE-Ⅱ（25、50、100 ng/m L）作用于肝癌細(xì)胞MHCC97-H不同時間點（24、48、72 h）后，對MHCC97-H細(xì)胞的生長增殖有一定的促進作用。因此，本實驗以IGE-Ⅱ（50 ng/m L）刺激人肝癌細(xì)胞MHCC97-H 48 h，進一步觀察其對肝癌細(xì)胞MHCC97-H中癌基因C-myc及N-ras表達的影響，進而明晰相關(guān)分子機制。本研究利用細(xì)胞免疫熒光、Western blot及Real-time PCR等方法，從蛋白及mRNA水平對MHCC97-H中C-myc及N-ras的表達進行定性、定位及定量分析。結(jié)果表明，IGE-Ⅱ可明顯上調(diào)MHCC97-H細(xì)胞中癌基因C-myc及N-ras蛋白及mRNA表達，說明IGE-Ⅱ信號通路與C-myc及N-ras癌基因的表達途徑上有交匯點，可以相互促進，而癌基因的過度表達又可進一步導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展。

C-myc基因是myc基因家族的成員之一，作為原癌基因其編碼的蛋白質(zhì)屬于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞外向細(xì)胞核內(nèi)生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［8-10］。以前的研究發(fā)現(xiàn)，C-myc蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)出高度表達，而在癌旁組織中呈現(xiàn)出低表達，在正常肝組織中則表達更少；進一步的研究還顯示，C-myc的蛋白表達與肝癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無關(guān)，而與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，提示C-myc的表達增強與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以作為判斷肝癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一，與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)［11-12］。研究證實，N-ras原癌基因通過G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其表達異常被認(rèn)為是肝癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化較早的分子表達變化，其表達水平隨肝癌的惡性分化程度而逐漸增強，并且N-ras基因的表達水平增高還為癌變的腫瘤細(xì)胞提供了良好的生長環(huán)境［13-14］。此外研究報道，C-myc和N-ras基因的表達水平增高，還與肝細(xì)胞的增殖調(diào)控失衡以及肝癌進展密切相關(guān)。IGE-Ⅱ被認(rèn)為是多種腫瘤細(xì)胞重要的自分泌生長因子，其過度表達具有明顯的促進細(xì)胞增殖及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用［15］。本實驗結(jié)果顯示IGE-Ⅱ作用時，癌基因C-myc、N-ras表達上調(diào)，提示可能是IGE-Ⅱ促進肝癌細(xì)胞增殖的分子機制之一，亦為臨床上肝癌的防治提供了一些新線索。

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（編輯 國 榮）

Effect of IGF-Ⅱon C-myc and N-ras expressions in MHCC97-H cells

Objective To investigate the effect of insulin-like growth factor-Ⅱ（IGF-Ⅱ）on the expressions of oncogenes（C-myc and N-ras）in MHCC97-H cells.Methods Human HCC cell lines（MHCC97-H）were cultured and stimulated with IGF-Ⅱ（50 ng/m L）for 48 h.The expressions of C-myc and N-ras were identified with immunofluorescence.Furthermore，the protein expressions of C-myc and N-ras were detected by Western blot. mRNA levels of C-myc and N-ras were determined by Real-time PCR.Results Positive expressions of C-myc and N-ras could be found in the nucleus of MHCC97-H cells.Compared with those in the controls，immunofluorescent expressions of C-myc and N-ras were evidently enhanced by IGF-Ⅱ（P＜0.05）.Moreover，protein expressions of C-myc and N-ras were significantly increased by IGF-Ⅱ（P＜0.05）.m RNA levels of C-myc and N-ras were also obviously increased by IGF-Ⅱ（P＜0.05）.Conclusion IGF-Ⅱcan upregulate the expressions of oncogenes C-myc and N-ras in MHCC97-H cells，thus inducing the proliferation of hepatocellular carcinoma.

insulin-like growth factor-Ⅱ（IGF-Ⅱ）；hepatocellular carcinoma；proliferation；C-myc；N-ras

R735.7

A

10.7652/jdyxb201505004

2015-02-16

2015-04-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81201925）；西安交大二院人才培養(yǎng)專項科研基金資助項目［No.RC（GG）201404］Supported by the National Natural Science Eoundation of China（No.81201925）and Personnel Training Specialized Research Eoundation of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University（No.RC（GG）201404）.

王志東.E-mail：xawzd@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150720.1640.010.html（2015-07-20）

JI Yuan-yuan1，WANG Zhi-dong2，YANG Zheng-an2，WANG Bao-tai2，SHI Min2，HUI Bo2，LEI Ni-na2，YUE Wei-na2

（1.Scientific Research Center；2.Department of VIP General Surgery，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004，China）