油污土壤降解細(xì)菌的分離鑒定及其生物強(qiáng)化研究

曲麗娜　賈洪柏　王秋玉

摘 要：從大慶油田長期石油污染的土壤中分離出高效降解石油烴的菌株5種，通過生理生化分析和16SrDNA全序列分析，初步確定為Pseudomonas sp.（假單胞菌屬）、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌屬）、Acinetobacter junii（瓊氏不動桿菌屬）、Microbacterium oxydans（微桿菌屬）、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌屬）。在搖瓶培養(yǎng)和土壤固體培養(yǎng)條件下的石油烴降解率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出了對照組。同時通過改變初始鹽濃度、N源和P源，初步探測了各菌株的最適生長和降解條件，為本土微生物強(qiáng)化的生物修復(fù)方法提供了新的菌種資源和信息，對進(jìn)一步有效實(shí)現(xiàn)本土微生物強(qiáng)化具有重要意義。

關(guān)鍵詞：生物強(qiáng)化；石油污染土壤；細(xì)菌；降解率

中圖分類號 X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）11-17-05

Abstract：5 bacterial strains were isolated from the long-term petroleum-contaminated soil in the Daqing oilfield which can efficiently degrade petroleum hydrocarbons. Using physiological and biochemical assays，as well as 16S rRNA sequencing analysis，we identified these strains as Pseudomonas sp.，Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter junii，Microbacterium oxydans，and Pseudomonas aeruginosa.Under both liquid and solid（i.e.soil）culture conditions，these bacterial strains showed much higher petroleum hydrocarbon degrading rates than the control strain. By modulating the concentration of initial salt，N and P in the medium，we explored the optimal growth and degradation conditions of the bacterial strains. This study provides new bacterial resources and information for the autochthonous bioaugmentation of crude oil contaminated soil.

Key words：Bioaugmentation；Oil-contaminated soil；Bacteria；Degradation rate

“Autochthonous bioaugmentation”（本土生物強(qiáng)化）技術(shù)是由日本科學(xué)家Ueno Akio等于2007年首次提出的，主要指從石油污染的土壤中分離出具有石油降解能力的本土微生物，將其富集后重新投入到石油污染土壤中進(jìn)行生物強(qiáng)化試驗的技術(shù)[1]。Ueno從生物刺激試驗土壤中分離出有高效降解能力的菌株J，將其富集后重新投放到污染土壤中進(jìn)行生物強(qiáng)化試驗，得到了較好的結(jié)果，TPH降解率達(dá)50%左右，比同等條件下用外源菌株WatG的強(qiáng)化處理效率高[1]。Das等的研究進(jìn)一步體現(xiàn)了本土微生物在強(qiáng)化處理時的優(yōu)越性，他們用從石油污染土壤中分離出的3種細(xì)菌進(jìn)行生物強(qiáng)化試驗時發(fā)現(xiàn)，三者均可以顯著降低土壤中TPH的含量；而且在加入這些細(xì)菌后，土壤中細(xì)菌的生長和生物表面活性劑的產(chǎn)量都有所提高[2]。這些結(jié)果均說明在應(yīng)用本土微生物進(jìn)行生物強(qiáng)化試驗時比用外源微生物強(qiáng)化時有較明顯的優(yōu)勢。為此，筆者從原位石油污染的土壤中分離能夠有效利用石油烴的細(xì)菌，并對其降解規(guī)律進(jìn)行研究，同時改變不同形式的N源、P源、鹽濃度、pH值，以期獲得進(jìn)行微生物生物強(qiáng)化的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 石油污染土壤 石油污染土壤樣品采自大慶油田20世紀(jì)60年代開采的油井附近的石油污染土壤，分別采集地表、10cm和20cm處的土壤，裝入無菌袋中密閉，分別置于4℃和-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 原油 原油取自黑龍江大慶油田，室溫下為黑色粘稠固體。以石油醚為溶劑（沸程60～90℃）溶解，制成10%（100g/L）的石油原液，裝入深棕色的試劑瓶中，置于涼爽陰暗處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實(shí)驗所需培養(yǎng)基 （1）富集液體培養(yǎng)基（g/L）：NaCl1.0，K2HPO4·3H2O1.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O0.5，NH4NO31.0，

CaCl20.02，F(xiàn)eCl3 痕量，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，pH7.0；（2）分離培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，pH7.0～7.2，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g/L；（3）無機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）：NaCl1.0，K2HPO4·3H2O1.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O0.5，NH4NO31.0，CaCl20.02，F(xiàn)eCl3痕量，pH7.0。（4）土壤榨取液培養(yǎng)基：將400g的對照土樣懸浮于1 000mL蒸餾水中，4 000r/min離心10min去除土壤顆粒，濾紙過濾，重復(fù)上述操作，直至濾液澄清，pH7.0，121℃滅菌20min后備用。

1.2 方法

1.2.1 石油降解細(xì)菌的分離與鑒定 將5g石油污染土壤樣品加入45mL含油1%的富集液體培養(yǎng)基中，30℃、160r/min震蕩培養(yǎng)3d。吸取5mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入45mL新鮮的不含牛肉膏的富集液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為1%的石油，在與上述相同的培養(yǎng)條件下連續(xù)轉(zhuǎn)接5次[3]。采用稀釋平板法進(jìn)行分離，得到單菌株。在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中將菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用無菌水充分洗滌3次，以除去殘留培養(yǎng)基，以無菌水為空白對照，用分光光度計在800nm和250nm之間進(jìn)行波長掃描，以確認(rèn)各菌株的特征吸收波長[4]。再進(jìn)行生理生化實(shí)驗，并對其16SrDNA進(jìn)行測序，回收的PCR產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行序列測定，將測得的序列于NCBI上比對，判斷細(xì)菌的種屬。

1.2.2 液體培養(yǎng)條件下石油降解細(xì)菌降解性能測定 將搖瓶過夜培養(yǎng)的菌液接入含油1%的無機(jī)鹽培養(yǎng)液和土壤榨取液中，接種量為1%（v/v），30℃，160r/min培養(yǎng)，分別在第1、3、6、10、15天取3瓶進(jìn)行萃取[5]，計算石油降解率。降解率計算公式為：

降解率（%）=[1-（W1-W2）W0×100]

式中：W0為初始石油質(zhì)量（g）；W1為錐形瓶+樣品中殘油的質(zhì)量（g）；W2為錐形瓶的質(zhì)量（g）。

1.2.3 固體培養(yǎng)條件下石油降解細(xì)菌降解性能測定 將過夜培養(yǎng)的菌液接入滅菌的含油1%的油污土壤中，接種量為3%，與土壤充分混勻后，30℃靜置培養(yǎng)，于第5、10、15天各取3瓶進(jìn)行萃取，降解后的土壤分別用正己烷、二氯甲烷和三氯甲烷沖洗，將3次的上清液合并，在60℃左右的溫度下于通風(fēng)櫥中使有機(jī)溶劑揮發(fā)至恒重，干燥器中冷卻恒重后稱量，計算石油降解率。

1.2.4 石油降解細(xì)菌原位修復(fù)的生物強(qiáng)化試驗 分別研究初始鹽濃度、不同氮源和不同磷源對石油降解細(xì)菌生長及石油降解率的影響。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，改變鹽濃度為1%、3%、5%和7%；用氮元素質(zhì)量相當(dāng)?shù)腘aNO3、（NH4）2SO4、NH4Cl代替NH4NO3作為N源；用磷元素質(zhì)量相當(dāng)?shù)腒H2PO4、K2HPO4、NaH2PO4代替KH2PO4/K2HPO4作為P源，分別接入過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，接種量均為1%，30℃、160r/min培養(yǎng)7d，測定培養(yǎng)液中菌的OD值和石油降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油降解細(xì)菌的分離與鑒定 分離出5株高效石油降解細(xì)菌，分別編號為X3、X5、X9、X11和X12。經(jīng)紫外分光光度計測定，5株細(xì)菌的最大吸收波長均在320cm左右，在測定X3、X5和X9的OD值時選用320nm，測定X11和X12的OD值時則選用300nm。

2.1.1 各菌株的生理生化實(shí)驗 經(jīng)過革蘭氏染色等8項生理生化鑒定實(shí)驗，結(jié)果見表1。

2.1.2 耐鹽性試驗 將各菌株分別接種于鹽濃度為1%、2%、5%、10%、15%和20%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3d后X3和X5菌株在10%的鹽濃度下仍略有生長，耐鹽性最好；X9在鹽濃度為5%時略有生長，10%以上不生長，耐鹽性相對較差；X11和X12在5%的鹽濃度下生長良好，但在10%及以上的鹽濃度下不生長，耐鹽能力居中。

2.1.3 耐酸堿性試驗 5個菌株在pH4.0～9.0的pH區(qū)間內(nèi)均可生長，在pH4.0時，僅有X3菌株表現(xiàn)出較好的耐酸性，其余4種菌株均在堿性條件下生長狀態(tài)高于酸性條件下，并pH8.0和9.0時生長達(dá)到最大，表現(xiàn)出較好的耐堿性。這些菌株生長在鹽堿性較高的大慶土壤，在逐步適應(yīng)環(huán)境的過程中形成了較好的耐堿性，有效的對土壤中石油烴進(jìn)行生物降解。

2.1.4 細(xì)菌16SrDNA鑒定 將獲得的菌株序列經(jīng)Blast比對，取同源性最高的20條序列，用DNAStar軟件的MegAlign程序，選用ClustalW法進(jìn)行多序列比對分析，然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合生理生化實(shí)驗的鑒定結(jié)果確定各菌株的種屬。表2中描述了5種菌株比對的結(jié)果。從圖2中可看出，X3號菌株單聚一類，其余4種親緣關(guān)系較近，與耐酸堿性的特征劃分相符。

2.2 不同培養(yǎng)條件下細(xì)菌的降解性能

2.2.1 無機(jī)鹽培養(yǎng)液條件下細(xì)菌的降解性能 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中僅有石油作為唯一碳源，能夠充分體現(xiàn)石油降解細(xì)菌對石油的利用程度。X3和X5菌株在培養(yǎng)的初期就表現(xiàn)出較高的降解率（40%左右），并且在15d內(nèi)一直保持領(lǐng)先，最終達(dá)到了近60%的降解率；X9降解率最低，1d時與空白相當(dāng)，15d時只有X5降解率的50%左右，但也明顯高于空白樣品中石油烴的自然降解率。5種細(xì)菌都能夠較好的利用石油烴作為碳源。

2.2.2 土壤固體培養(yǎng)條件下的降解性能 在土壤固體培養(yǎng)基中最接近自然環(huán)境下石油降解細(xì)菌生長的環(huán)境，X3和X5在15d時降解率仍然最高，分別達(dá)75%和72%；其次是X9和X11，15d的降解率分別達(dá)68%、64.34%；最后是X12，15d的降解率達(dá)59%。由此可見，雖然各菌株之間的降解效率略有不同，但均處于較高水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組，所以各菌株在固體培養(yǎng)條件下對石油也表現(xiàn)出較好的降解能力，因此以上5個菌株可被稱為高效的石油降解菌株，為其應(yīng)用于土壤的原位及異位生物修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

2.3 石油降解細(xì)菌原位修復(fù)的生物強(qiáng)化試驗

2.3.1 鹽濃度對細(xì)菌生長及石油降解率的影響 由表3可以看出，除X9菌株在7%的鹽濃度下不生長外，其它菌株在這4種鹽濃度下均可生長。X3菌株在5%鹽濃度下生長最差，其余4種菌株均在7%鹽濃度下生長最差，相對的石油降解率也最低；X3和X11菌株的最適生長鹽濃度為1%，X5、X9和X12菌株的最適鹽濃度為3%，石油降解率均在最適鹽濃度下最高。

2.3.2 氮源對細(xì)菌生長及石油降解率的影響 由圖5，6顯示，5株原油降解細(xì)菌幾乎都在以NaNO3為N源時生長的最好，但相對其石油降解率卻都是最低的；而在生長狀況一般的以（NH4）2SO4為氮源條件下，石油降解率卻都處于較高的水平。總體看來，N源對石油降解率的影響出現(xiàn)了反相關(guān)的趨勢，這可能是代謝石油烴有關(guān)的酶等活性物質(zhì)，在不同N源生長條件下活性差別較大。因此，要達(dá)到強(qiáng)化細(xì)菌石油降解率的條件，需選擇降解率較高的NH4NO3作為N源。

2.3.3 磷源對細(xì)菌生長及石油降解率的影響 如圖7所示，各菌株在以K2HPO4·3H2O和K2HPO4·3H2O/KH2PO41∶1為P源時生長較好，而在以KH2PO4和NaH2PO4的生長較差，尤其是對于X9來說，在這2種P源條件下幾乎不生長。圖8表示磷源對各菌株石油降解率的影響，除X11外，其它菌株在以K2HPO4·3H2O為P源時的降解率幾乎與生長成反比，而在以K2HPO4·3H2O/KH2PO41∶1為P源的降解率幾乎與生長成正比，每個菌株基本都達(dá)到較好的降解效率；對X3和X5來說，雖然在以KH2PO4和NaH2PO4為P源時的生長較差，但降解率卻較高，而對于其它菌株來說，由于在以KH2PO4和NaH2PO4為P源時的生長很差，X9幾乎不生長，所以降解率都較低。因此，從總體來看，各菌株在以K2HPO4·3H2O/KH2PO41∶1為P源時的生長和降解率都較好，所以最適的P源應(yīng)為K2HPO4·3H2O/KH2PO41∶1。

2.4 討論

2.4.1 石油污染時間影響細(xì)菌的石油降解能力 由于大慶地區(qū)土壤鹽堿性較強(qiáng)，從中分離出的5種細(xì)菌也都表現(xiàn)出了較好的耐鹽堿性。同時5種細(xì)菌分離自不同的污染時間和不同深度的土層，其中X3、X5和X11菌株是在近期污染的地表土中分離得到的，它們在培養(yǎng)的初期就表現(xiàn)出較好的降解效率（40%左右）?？赡苡捎谠撏翗赢?dāng)中的細(xì)菌在采集前經(jīng)過石油污染物的刺激，降解石油相關(guān)的機(jī)制已經(jīng)開啟，所以能較好的適應(yīng)高濃度的石油污染條件，并對石油表現(xiàn)出較高的降解效率。在長期污染（5a以上）的土樣中分離得到了X12和X9菌株，其中X12來自地表5cm土層樣品，X9菌株來自20cm土層樣品。X12的石油降解能力較好，地表污染較重，細(xì)菌的石油降解機(jī)制可能一直處于被激活的狀態(tài)；而由于石油污染在土壤中擴(kuò)散速率很慢，處于深層土壤的X9菌株的石油降解能力表現(xiàn)不如其他幾種菌株突出。

2.4.2 N、P源影響細(xì)菌石油降解效率 在改變不同形式的N源和P源時發(fā)現(xiàn)，在生長狀態(tài)好的N、P源條件下，菌株的石油降解率相對較低，而在生長狀態(tài)較低的N、P源條件下，菌株的石油降解率反而相對較高。這可能是由于與細(xì)菌降解石油所需的酶等活性物質(zhì)的表達(dá)受不同N、P源的調(diào)控，而這種調(diào)控與細(xì)菌細(xì)胞生長繁殖有關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，能夠激活石油降解有關(guān)基因卻會抑制細(xì)菌的生長。Audrew等[6]研究原油在土壤中泄漏后的生物降解能力時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加肥料的C∶N∶P=100∶5∶1.7并為緩慢釋放形式時，效果最佳；其中N源主要利用NH4+，P源主要利用PO43-，與本研究的結(jié)果一致。因此，在利用微生物生物強(qiáng)化進(jìn)行生物修復(fù)時，應(yīng)當(dāng)首先確定能夠激活降解相關(guān)基因的N、P源種類，然后確定各物質(zhì)所需的最適濃度，以保證石油降解細(xì)菌達(dá)到最佳的降解效果。

3 展望

利用微生物降解土壤中的石油污染物已經(jīng)成為土壤生物修復(fù)技術(shù)的研究熱點(diǎn)，已分離篩選出許多高效石油降解微生物，但是微生物降解石油污染物受許多復(fù)雜因素影響，如營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣、溫度、石油烴的種類等[7]。作為土壤生物修復(fù)技術(shù)的核心，為了更有效的利用已分離出的石油降解微生物，最大限度的提高降解效率，還需要從以下幾個方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探討：

（1）已篩選出的高效石油降解微生物通常來自污染地區(qū)的本土微生物，其生長條件和對營養(yǎng)的需求都有較強(qiáng)的環(huán)境針對性，因此需要針對不同地域特點(diǎn)，結(jié)合地理、氣候、土壤特性、污染強(qiáng)度、地下水埋深等影響因素，深入探討微生物修復(fù)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的種類、基質(zhì)投加量、混合菌劑對污染物降解的影響，建立適合本土微生物的最佳生物強(qiáng)化方案，最大限度的發(fā)揮其生物修復(fù)的功效。

（2）石油污染物成分復(fù)雜，包括多種烷烴和芳烴，尤其是其中的多環(huán)芳烴，種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，毒性強(qiáng)，一直是困擾環(huán)境治理的難題。對微生物利用石油烴的機(jī)理研究是目前微生物修復(fù)工作的重中之重，研究烷烴代謝模型、影響烷烴降解酶合成的阻遏物和激活物、芳香烴代謝過程等，才能更有針對性的設(shè)計和完善微生物修復(fù)技術(shù)，使其具有更強(qiáng)的適用性和有效性。

（3）結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，探討微生物降解石油烴污染物的分子機(jī)理，尋找與降解代謝相關(guān)的酶基因。Beilen[8-9]發(fā)現(xiàn)Pseudomonas putida GPO1編碼降解烷烴酶的操縱子主要位于OCT質(zhì)粒，Marin[10]報道Burkholderia cepacia中控制烷烴降解的alkB操縱子比P.putida GPO1中的操縱子更容易被代謝產(chǎn)物中的阻遏物負(fù)調(diào)控。掌握石油烴降解酶的種類、活性、序列、調(diào)控機(jī)理，有助于開發(fā)和構(gòu)建高效的石油烴降解工程菌，達(dá)到快速高效的修復(fù)效果。

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（責(zé)編：張宏民）