北方春玉米區(qū)玉米穗腐病禾谷鐮孢菌復(fù)合種SCAR類型測定

董懷玉，王大為，王麗娟，劉可杰，姜鈺，徐秀德，左馳（.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，沈陽06；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，沈陽06；.撫順市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，遼寧撫順008）

北方春玉米區(qū)玉米穗腐病禾谷鐮孢菌復(fù)合種SCAR類型測定

董懷玉1，王大為2*，王麗娟1，劉可杰1，姜鈺1，徐秀德1，左馳3
（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，沈陽110161；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，沈陽110161；3.撫順市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，遼寧撫順113008）

利用禾谷鐮孢菌特異性引物Fg16F/R，對分離自我國北方春玉米區(qū)玉米穗腐病籽粒病原禾谷鐮孢菌復(fù)合種（Fusarium graminearum clade）的45株菌株作SCAR類型測定，并通過基因序列測定解析。結(jié)果表明，我國北方玉米穗腐病籽粒中攜帶的病原禾谷鐮孢菌復(fù)合種存在兩種SCAR類型：即類型1（F.graminearum）和類型5（F.asiaticum），分別占供試菌株的80%和20%，并以F.graminearum為優(yōu)勢致病種類。

玉米；禾谷鐮孢菌復(fù)合種；SCAR類型；PCR

玉米穗腐病是世界性玉米病害，由20多種病原真菌侵染玉米果穗或籽粒所致，國內(nèi)外對其主要致病菌研究結(jié)果基本一致，以鐮孢菌（Fusarium spp.）為優(yōu)勢菌群[1-4]。國外報導(dǎo)常見鐮孢菌主要有禾谷鐮孢菌（F.graminearum）、擬輪生鐮孢菌（F.verticilliods）、亞粘團鐮孢菌（F.subglutinans）、層出鐮孢菌（F.proliferatum）以及黃色鐮孢菌（F.culmorum）和木賊鐮孢菌（F.equiseti）等[5-6]；而國內(nèi)報道有串珠鐮孢菌（F.moniliforme）、禾谷鐮孢菌、黃色鐮孢菌、尖鐮孢菌（F.oxysporum）、木賊鐮孢菌、亞粘團鐮孢菌和層出鐮孢菌等。不同地區(qū)優(yōu)勢病原菌種群可能存在差異，但多數(shù)認(rèn)為串珠鐮孢菌為優(yōu)勢致病菌，禾谷鐮孢菌為次優(yōu)勢致病菌[7-8]。串珠鐮孢菌和禾谷鐮孢菌為兩個復(fù)合種群，即串珠鐮孢菌復(fù)合種（F.moniliforma clade）和禾谷鐮孢菌復(fù)合種（F.graminearum clade），均存在豐富的種群多樣性[9]。近年來國內(nèi)學(xué)者對引起麥類赤霉病的禾谷鐮孢菌復(fù)合種種群多樣性作系統(tǒng)研究，證明中國麥類赤霉病病原禾谷鐮孢菌復(fù)合種存在兩種SCAR類型，即類型1（F.graminearum）和類型5（F.asiaticum）[10-11]；目前已有玉米穗腐病病原禾谷鐮孢菌復(fù)合種構(gòu)成等作分子鑒定研究[12-13]，但北方春玉米產(chǎn)區(qū)玉米穗腐病病原禾谷鐮孢菌復(fù)合種的SCAR類型鑒定未見報道。

本研究針對我國北方春玉米產(chǎn)區(qū)玉米穗腐病日趨嚴(yán)重問題，利用禾谷鐮孢菌種類特異性PCR引物Fg16F/R（由北京鼎國昌盛合成），對從我國北方春玉米區(qū)收集的玉米穗腐病籽粒樣本中分離獲得的部分禾谷鐮孢菌復(fù)合種作分子鑒定，旨在明確穗腐病病原禾谷鐮孢菌復(fù)合種類型構(gòu)成，為北方春玉米區(qū)開展玉米穗腐病產(chǎn)毒素類型及病害綜合治理提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 禾谷鐮孢菌菌株及其來源

本研究供試的禾谷鐮孢菌復(fù)合種菌株共56個：其中從我國北方春玉米區(qū)不同地區(qū)收集的玉米穗腐病籽粒樣本中分離獲得禾谷鐮孢菌復(fù)合種菌株45個，包括遼寧省28株，吉林省10株，黑龍江省4株，河北省3株；從黑龍江不同地區(qū)收集的小麥赤霉病、水稻穗腐病籽粒上分離獲得禾谷鐮孢菌復(fù)合種菌株分別為5株和4株；來源于德國分離自小麥籽粒樣本的兩株F.graminearum對照菌株，菌株來源見表1。供試菌株保存于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所。

1.2 菌體培養(yǎng)與DNA提取

采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）培養(yǎng)法，供試菌株經(jīng)單孢分離純化后接種于裝有100 mL PD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于振蕩培養(yǎng)箱（HZQF160）中120 r·min-1、25℃條件下培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲于5 mL離心管中，冷凍干燥機-110℃凍干2～3 d，取出后研磨成粉末，依照Nicholson等CTAB法提取DNA，并稀釋于1×TE溶液中5℃條件保存[14-15]（-40℃條件下冷凍長期保存）。

表1 菌株來源Table 1 Origin of strains

1.3 PCR擴增及SCAR類型DNA序列測定

PCR反應(yīng)采用25μL體系：10×buffer 2.0μL，10 mmol·L-1dNTP 0.3μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，模板DNA 1.0μL，上下游引物各0.3μL（10 μmol·L-1），ddH2O補足至25μL。特異性引物Fg16F/R[16]序列如下：

Fg16F：5'CTCCGGATATGTTGCGTCAA；

Fg16R：5'GGTAGGTATCCGACATGGCAA。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取10.0μL擴增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后EC3凝膠成像系統(tǒng)下照相。

篩選不同類型的部分代表性禾谷鐮孢菌菌株進行Fgl6F/R基因片段擴增，利用DNA回收試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物純化回收后，ABIPRISM DNA測序儀（Perkin-Elmer）上序列測定。

圖1 Fg16F/R的PCR多態(tài)性Fig.1 PCR polymorphic types with primers Fg16F/R

2 結(jié)果與分析

2.1 Fg16F/R的PCR多態(tài)性測定

特異性PCR引物Fgl6F/R只特異性擴增禾谷鐮孢菌某一DNA片段，并產(chǎn)生單一的特異性產(chǎn)物，每類禾谷鐮孢菌在瓊脂糖凝膠上電泳時只產(chǎn)生唯一一條0.4～0.5 kb條帶，其他真菌以此引物擴增不能獲得PCR產(chǎn)物[16-17]。通過對供試的45株玉米穗腐病禾谷鐮孢菌菌株P(guān)CR擴增，結(jié)果表明，我國北方春玉米區(qū)玉米穗腐病禾谷鐮孢菌復(fù)合種存在兩種SCAR類型（見圖1A）：其中，有36個菌株穩(wěn)定擴增出與SCAR類型1對照菌株D1相同的特異性PCR產(chǎn)物條帶，表明其種類為F.graminearum，占80%；其他9個菌株穩(wěn)定擴增出500 bp左右的特異性條帶，只占20%。

同時利用Fgl6F/R對9株分離自黑龍江的小麥赤霉病和水稻穗腐病籽粒上的禾谷鐮孢菌復(fù)合種菌株P(guān)CR擴增，測定結(jié)果同樣只存在兩種SCAR類型（見圖1B）：其中分離自小麥患病籽粒的3個菌株和分離自水稻患病籽粒的1個菌株P(guān)CR產(chǎn)物條帶與對照菌株D1條帶相同，分別占75%和20%；其余分離自小麥的1個菌株和水稻的4個菌株P(guān)CR產(chǎn)物條帶與玉米另一個SCAR類型條帶相同，分別占25%和80%。

2.2 Fg16F/R的PCR產(chǎn)物基因序列測定

篩選CHG003、CHG030、CHG113、CHG120和CHG004、CHF22、CHF43等代表兩種SCAR類型的7個菌株，對其Fgl6F/R的PCR產(chǎn)物進行序列測定，分析其序列特征性擴增區(qū)段（SCAR）多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)菌株CHG030和CHG120 PCR產(chǎn)物序列與USA1（類型1）序列完全一致，CHG003和CHG113 PCR產(chǎn)物序列與D1序列完全一致，序列長度均為410 bp，二者僅在352位點的核苷酸不同（T-A），與已知禾谷鐮刀菌SCAR類型PCR產(chǎn)物序列比對，證明其為SCAR類型1（見圖2）；而菌株CHG004、CHF22和CHF43 PCR產(chǎn)物序列長度為497 bp，與WL1（類型5）的序列在53位點和79位點的核苷酸發(fā)生變化（A-T和T-C），且菌株CHG004在399位點的核苷酸由G變化為A。通過與已知禾谷鐮刀菌SCAR類型PCR產(chǎn)物序列比對發(fā)現(xiàn)，供試3個菌株特征性擴增區(qū)段序列在79-108區(qū)段和169-198區(qū)段有一個30個核苷酸類似重復(fù)序列，且在109-168區(qū)段的核苷酸序列發(fā)生缺失，由此證明其為SCAR類型5[17]。

綜上試驗結(jié)果表明，我國北方禾谷類作物穗腐?。ǔ嗝共。┎≡坦如犳呔鷱?fù)合種均存在兩種SCAR類型：即類型1和類型5，種類分別為F.graminearum和F.asiaticum[15,18]；玉米穗腐病和小麥赤霉病禾谷鐮孢菌復(fù)合種均以F.graminearum為優(yōu)勢致病種類，而水稻穗腐病則以F.asiaticum為優(yōu)勢致病種類。供試菌株SCAR類型測定結(jié)果見表2。

圖2 禾谷鐮孢菌菌株Fg16F/R的PCR產(chǎn)物序列比對結(jié)果Fig.2 Nucleotide sequence alignment ofthe Fgl6F/R PCR products from isolates of F.graminearum

表2 菌株SCAR類型測定結(jié)果Table 2 Results ofdetection ofstrains SCAR types

3 討論與結(jié)論

近年隨氣候和耕作方式變化，尤其是高密度種植、秸稈還田以及免耕機械化種植技術(shù)大面積推廣與應(yīng)用，以玉米苗枯病、莖腐病、穗腐病、褐斑病和紋枯病為重點的土種傳病害在我國發(fā)生為害趨勢上升明顯，受玉米育種歷程、生產(chǎn)條件和方式改變的不可逆性以及該類病害多在植株生長中后期發(fā)生為害特點，田間治理和防控難度較大，尤其玉米穗腐病，不僅直接影響玉米品質(zhì)，造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失，因優(yōu)勢致病鐮孢菌（包括F.verticillioides和F.graminearum）在生長代謝中產(chǎn)生付馬菌素（Fumonisins）、脫氧鐮孢菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、鐮孢菌烯醇（Nivalenol，NIV）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等真菌毒素，造成人和動物中毒，甚至對人畜具有致癌、致畸作用，對人畜健康造成威脅。而禾谷鐮孢菌群是鐮孢菌中主要的產(chǎn)毒菌群，其產(chǎn)毒類型具有一定地理分布特征，并與其復(fù)合種群中的不同種類有關(guān)[19-23]。本研究通過對分離自北方春玉米區(qū)玉米穗腐病籽粒的禾谷鐮孢菌復(fù)合種進行SCAR多態(tài)性測定，明確在目前生產(chǎn)條件下我國北方春玉米區(qū)玉米穗腐病禾谷鐮孢復(fù)合種存在兩種SCAR類型，即類型1（F.graminearum）和類型5（F.asiaticum），以F.graminearum為優(yōu)勢致病種類，占80%；并明確其地理分布，其中來源于遼寧玉米的28個菌株中包含2個類型（23株和5株），來源于吉林的10個菌株和河北的3個菌株均為類型1，而來源于黑龍江的4個菌株則均為類型5。該結(jié)果為進一步開展玉米穗腐病相關(guān)研究提供基礎(chǔ)信息，對北方春玉米區(qū)開展病害防控和制定食品安全措施具有重要意義。

研究證明，引起麥類赤霉病的禾谷鐮孢菌同樣存在類型1和類型5兩種SCAR類型，以類型5為優(yōu)勢致病種類，麥類赤霉病禾谷鐮孢菌存在明顯生態(tài)地理類型[10,24]：類型1為“冷涼型菌系”，群體相對較小且有明顯地區(qū)分布局限性，主要分布在黑龍江、陜西以及河南、湖北、江西等冷涼地區(qū)；而類型5為“溫暖型菌系”，分布于我國大部分地區(qū)，尤其是溫暖麥區(qū)。從本研究供試的玉米穗腐病禾谷鐮孢菌2個SCAR類型數(shù)量分布來看，以類型1為主，總體符合麥類赤霉病禾谷鐮孢菌兩種類型分布格局。但玉米穗腐病禾谷鐮孢菌2個SCAR類型在不同省區(qū)地理分布存在差異，類型1分布于遼寧、吉林和河北，類型5分布于遼寧和黑龍江，尤其是來源于黑龍江的4個菌株則均為SCAR類型5，其結(jié)果不同于麥類赤霉病禾谷鐮孢菌生態(tài)地理類型的分布，呈現(xiàn)出類型5分布于“冷涼”地區(qū)而類型1分布于“溫暖”地區(qū)的格局。本研究對來源于黑龍江的小麥和水稻部分禾谷鐮孢菌菌株進行分子測定，分離自小麥赤霉病籽粒的4個菌株有3株為類型1，1株為類型5，結(jié)果與前人研究一致[10-12]，但分離自水稻穗腐病籽粒的5個菌株則均為類型5，與來源于該省玉米穗腐病的4個菌株測定結(jié)果一致。由此表明，禾谷類作物致病禾谷鐮孢菌復(fù)合種種類組成不僅受氣候條件、地理環(huán)境等因素影響，也可能受寄主作物影響。

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SCAR type detection of Fusarium graminearum clade species complex on spring maize producing areas of north China

DONG Huaiyu1, WANG Dawei2,WANG Lijuan1,LIU Kejie1,JIANG Yu1,XU Xiude1,ZUO Chi3
(1.Institute of Plant Protection,Liaoning Academy of Agricultural Sciences,Shenyang 110161,China;2.Corn Research Institute,Liaoning Academy of Agricultural Sciences,Shenyang 110161,China; 3.Funshun AgriculturalTechnology Extension Center,Fushun Liaoning 113008,China)

Based on specific primers Fg16F/R of Fusarium graminearum,of 45 F.graminearum clade strains which were isolated from maize seeds of spring maize producing areas of north China were detected for the SCAR types.The results showed that Fusarium graminearum clade were detected two kinds of SCAR types,SCAR type 1 and SCAR type 5,the species were F.graminearum and F.asiaticum,separating rate was 80%and 20%,respectively,F.graminearum was superiority superiority type.

maize;Fusarium graminearum clade;SCAR types;PCR

S513

A

1005-9369（2015）10-0023-06

時間2015-10-29 13:41:01[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151029.1341.016.html

董懷玉,王大為,王麗娟,等.北方春玉米區(qū)玉米穗腐病禾谷鐮孢菌復(fù)合種SCAR類型測定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(10): 23-28.

Dong Huaiyu,Wang Dawei,Wang Lijuan,et al.SCAR type detection of Fusarium graminearum clade species complex on spring maize producing areas of north China[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(10):23-28.(in Chinese with English abstract)

2015-06-02

國家科技支撐計劃項目（2011BAD16B12，2012BAD04B03，2013BAD07B03）

董懷玉（1972-），男，研究員，研究方向為玉米、高粱等病蟲害防治和種質(zhì)抗性鑒定。E-mail:donghy618@163.com

*通訊作者：王大為，研究員，博士，研究方向為玉米高產(chǎn)高效栽培技術(shù)。E-mail:davidww2000@126.com