8-硝基白楊素誘導人肝癌HepG2細胞分化研究

何貴成，嚴思佳，丁 恩，艾小紅

（南華大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖南衡陽421001）

8-硝基白楊素誘導人肝癌HepG2細胞分化研究

何貴成，嚴思佳，丁 恩，艾小紅

（南華大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，湖南衡陽421001）

目的探討傳統(tǒng)中藥蜂膠的有效成分白楊素的人工半合成類似物8-溴-7-甲氧基白楊素，即8-硝基白楊素（BrMC）是否具有誘導人肝癌細胞分化作用。方法體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞，分別加入1.0μg/mL BrMC和1.0 μg/mL全反式維甲酸（ATRA），同時設溶媒對照組和空白對照組。瑞氏-姬姆薩染色法檢測BrMC誘導HepG2細胞形態(tài)與核質(zhì)比的變化；酶促反應試劑盒檢測BrMC和ATRA誘導HepG2細胞中堿性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）的活性；放射免疫法檢測甲胎蛋白（AFP）的質(zhì)量分數(shù)；Diamondstone分光光度法（速率法）檢測酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（TAT）的活性。結(jié)果1.0 μg/mL BrMC處理的細胞核質(zhì)比遠低于溶媒對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h的HepG2細胞液中AFP質(zhì)量分數(shù)，γ-GT、ALP、TAT活性分別與溶媒對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論BrMC能降低HepG2細胞核質(zhì)比、減少HepG2細胞的AFP分泌、有效地活化HepG2細胞TAT、ALP；且BrMC和ATRA均能抑制HepG2細胞γ-GT活性。BrMC通過以上作用誘導人肝癌細胞分化。

植物提取物； 肝腫瘤/病理學； 腫瘤細胞，培養(yǎng)的； 8-硝基白楊素； HepG2細胞； 分化； 誘導

肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一。肝癌在我國發(fā)病率高，占全球50%以上[1-2]。而目前提高肝癌療效大多傾向于依賴藥物治療，現(xiàn)有的常規(guī)化療藥物選擇性低、毒性作用嚴重，且單藥有效率很少超過25%[3]。因此，尋找選擇性高的抗肝癌藥物，仍是肝癌防治研究的重要方向。近年來，隨著癌細胞再分化概念的提出，惡性腫瘤的誘導分化治療已成為腫瘤生物學和腫瘤治療學的研究熱點和前沿領域。白楊素（5，7-二羥黃酮，chrysin）是一種具有廣泛藥理活性的天然黃酮類化合物，在蜂膠和蜂蜜中含量較高，并在多種惡性腫瘤中具有抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡作用，例如乳腺癌[4-5]。但基于白楊素的口服生物利用度差，其口服制劑被用于臨床腫瘤防治的可能性不大[6]。8-硝基白楊素（8-溴-7-甲氧基白楊素，BrMC）作為白楊素的一種新衍生物，具有良好的抗腫瘤作用。目前，許多學者發(fā)現(xiàn)，BrMC對腫瘤干細胞也有重要作用，BrMC能通過下調(diào)看家基因（βcatenin）抑制肝癌干細胞性能[7]。而目前有關(guān)BrMC誘導人肝癌HepG2細胞分化作用鮮有報道。

本研究擬體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞，通過瑞氏-姬姆薩染色法觀察BrMC是否具有誘導HepG2細胞分化作用，試圖尋求具有高效的、毒性作用小的治療人肝癌的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。BrMC由南華大學藥學系鄭興教授惠贈，性狀：黃色晶體；純度大于98%。全反式維甲酸（ATRA）購自Sigma公司。二甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司；吉姆薩染液購自Sigma公司；胰酶消化液購自碧云天生物試劑有限公司；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌HepG2細胞核質(zhì)比的測量 將清潔滅菌的22 mm×22 mm載玻片置6孔細胞培養(yǎng)板中，取對數(shù)生長期HepG2細胞，每孔2×104個細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁，吸棄培養(yǎng)基，加入含1.0 μg/mL BrMC和1.0 μg/mL ATRA的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。取出載玻片，進行瑞氏-姬姆薩染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，測量細胞核質(zhì)比。

1.2.2 細胞特異性酶和蛋白的測定 取對數(shù)期生長的細胞每毫升2×104個接種于50 mL培養(yǎng)瓶，每瓶1 mL，分別加入1.0μg/mLBrMC和1.0μg/mLATRA，同時設溶媒對照組[0.1%乙醇（EtOH）]、空白對照組，每組3個平行瓶，培養(yǎng)96 h后分別收集不同時期（0、24、48、96 h）細胞和培養(yǎng)液。采用超聲破碎法裂解細胞，放射免疫法測定細胞培養(yǎng)液的甲胎蛋白（AFP）質(zhì)量分數(shù)；酶促反應試劑盒檢測γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）和堿性磷酸酶（ALP）的活性；Diamondstone分光光度法（速率法）測定酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（TAT）的活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Students′t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BrMC對人肝癌HepG2細胞核質(zhì)比的影響 1.0μg/mL BrMC處理的細胞核質(zhì)比為（0.16±0.06），比同質(zhì)量濃度的ATRA[（0.15±0.03）]略高，遠低于溶媒對照組[（0.34± 0.06）]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明BrMC具有很強地誘導HepG2細胞分化的能力。見圖1。

圖1 BrMC對人肝癌HepG2細胞核質(zhì)比的影響

2.2 BrMC對人肝癌HepG2細胞AFP質(zhì)量分數(shù)的影響

1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中AFP質(zhì)量分數(shù)分別為（302±12）、（224±8）、（131±5）、（83±2）μg/g，1.0 μg/mL ATRA處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中AFP質(zhì)量分數(shù)分別為（318±10）、（214±9）、（150± 06）、（112±2）μg/g；溶媒對照組處理 0、24、48、96 h后HepG2細胞液中AFP質(zhì)量分數(shù)分別為（300±10）、（292±9）、（320±4）、（308±10）μg/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h后HepG2細胞液中AFP質(zhì)量分數(shù)分別與溶媒對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明BrMC能有效減少HepG2細胞的AFP分泌。見圖2。

圖2 BrMC對人肝癌HepG2細胞AFP含量的影響

2.3 BrMC對人肝癌HepG2細胞γ-GT活性的影響1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中γ-GT的活性分別為（68±5）、（46±3）、（33±3）、（23±1）U/g；1.0 μg/mL ATRA處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中γ-GT的活性分別為（68±4）、（29±3）、（22±1）、（17±1）U/g；溶媒對照組處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中 γ-GT的活性分別為（68±2）、（64±2）、（67±1）、（63±1）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理 24、48、96 h后 HepG2細胞液中γ-GT活性分別與溶媒對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明BrMC和ATRA均能抑制HepG2細胞GGT活性。見圖3。

圖3 BrMC對人肝癌HepG2細胞γ-GT活性的影響

2.4 BrMC對人肝癌HepG2細胞ALP活性的影響1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中ALP的活性分別為（349±12）、（576±15）、（870±31）、（1 185±46）U/g；1.0 μg/mL ATRA處理 0、24、48、96h后HepG2細胞液中ALP的活性分別為（349±10）、（680± 20）、（870±31）、（1 288±58）U/g；溶媒對照組處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中ALP的活性分別為（349±12）、（347±12）、（350±31）、（352±46）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h后HepG2細胞液中ALP活性分別與溶媒對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明BrMC和ATRA均能提高HepG2細胞ALP活性。見圖4。

圖4 BrMC對人肝癌HepG2細胞ALP活性的影響

2.5 BrMC對人肝癌HepG2細胞TAT活性的影響1.0 μg/mL BrMC處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中TAT的活性分別為（15.0±1.0）、（25.0±1.6）、（35.0±2.1）、（48.0±2.4）U/g；1.0 μg/mL ATRA處理 0、24、48、96 h后HepG2細胞液中TAT的活性分別為（17.0±0.8）、（24.5± 1.4）、（34.0±2.0）、（45.0±2.2）U/g；溶媒對照組處理0、24、48、96 h后HepG2細胞液中TAT的活性分別為（15.0± 0.8）、（17.0±0.8）、（15.0±0.8）、（17.6±1.0）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA組處理24、48、96 h后HepG2細胞液中TAT活性分別與溶媒對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明BrMC能夠有效地活化HepG2細胞TAT。見圖5。

圖5 BrMC對人肝癌HepG2細胞TAT活性的影響

3 討 論

一般認為，癌細胞是細胞在早期分化階段被致癌物轉(zhuǎn)化為低分化、高增殖的細胞；而在細胞接近于分化完成時，被致癌物轉(zhuǎn)化為高度分化的、低增殖的細胞。不管癌細胞是來自成熟細胞的反分化或來自未成熟細胞的異常分化，還是阻抑正常細胞的分化，都可以看作是一種細胞分化的疾病，目前已被證實有許多生成因子或化學物質(zhì)在體內(nèi)或體外可促進癌細胞分化而降低腫瘤惡性程度的事實，為發(fā)展抗癌治療開辟了一條新途徑──分化誘導治療[8]。

腫瘤細胞分化誘導治療是指在一些化學制劑的作用下，不殺傷腫瘤細胞，而誘導腫瘤細胞分化為正?；蚪咏＜毎硇?，以促進體內(nèi)腫瘤細胞分化來治療癌癥。隨著ATRA治療人急性早幼粒細胞白血病獲得顯著療效后，分化誘導療法已成為國際腫瘤研究的新熱點。Reddi等[9]研究結(jié)果顯示，PAX8/過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARγ）融合蛋白的表達可顯著促進甲狀腺癌細胞中PAX8、甲狀腺過氧化物酶（TPO）、鈉碘同向轉(zhuǎn)運（NIS）和甲狀腺球蛋白的過表達，從而誘導甲狀腺癌細胞的再分化，抑制甲狀腺癌細胞的生長；Haghpanah等[10]的體外研究表明，丙戊酸可誘導未分化甲狀腺癌細胞再分化，也能降低甲狀腺癌的腫瘤干細胞特性。因此，尋找高效、低毒分化誘導劑已成為藥物化療腫瘤的重點方向。

最新數(shù)據(jù)顯示，BrMC能通過不同的作用機制發(fā)揮抗腫瘤作用。例如BrMC能顯著抑制HER-2/neu-乳腺癌的增殖活性[11]；也可通過與噻唑烷酮類化合物不同結(jié)合的方式，激活PPARr抑制環(huán)氧醇2（COX-2）的活性[12]。

近30年來，隨著癌細胞的誘導分化和分化治療的發(fā)展，但有關(guān)肝癌細胞的分化研究報道尚不多。黃煒等[13]研究證實，丁酸鈉（SB）處理肝癌細胞后，細胞核質(zhì)比明顯減小，鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）、TAT和ALP活性明顯升高，AFP分泌量和γ-GT活力明顯下降，表明SB可誘導肝癌細胞再分化。ATRA是公認的細胞分化誘導劑，在治療人急性早幼粒細胞白血病方面已獲得顯著療效。最近研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可降低SMMC-7721細胞的AFP分泌量和γ-GT活性，升高ALP和加強TAT活性，增加清蛋白的分泌量[14-15]。AFP和γ-GT是2個公認的人類肝癌的標志物，而ALP和TAT只有在成熟分化的肝細胞中表達，是肝細胞成熟分化的標志。這些研究結(jié)果在體外細胞培養(yǎng)水平上證明了ATRA對SMMC-7721細胞的諸多惡性表型具有逆轉(zhuǎn)作用。因此，本研究擬體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞作為實驗對象，BrMC作為處理因子，通過與細胞分化誘導劑（ATRA）對比，觀察HepG2細胞形態(tài)與核質(zhì)比的變化、檢測細胞中ALP和γ-GT活性的變化及AFP質(zhì)量分數(shù)、TAT活性，以證實BrMC是否對人肝癌HepG2細胞存在誘導再分化作用。

眾所周知，肝癌細胞分化不良在形態(tài)學上主要表現(xiàn)為細胞明顯增大，染色深，核大，核圓呈多型，核質(zhì)比失常[16-17]。本研究在體外培養(yǎng)的HepG2細胞中分別加入1.0 μg/mL BrMC和1.0 μg/mL ATRA后，通過瑞氏-姬姆薩染色，光鏡顯微鏡下測量發(fā)現(xiàn)細胞核質(zhì)比明顯降低。提示BrMC具有誘導人肝癌細胞HepG2分化的效應。為探討肝癌細胞分化的指標，結(jié)合文獻報道，選用了4種可以反映肝細胞分化的酶和蛋白作為觀察對象。γ-GT和TAT均是肝癌的標志酶，γ-GT主要分布于肝、胰等組織，參與γ-谷氨酰循環(huán)，與肝癌的分化程度呈負相關(guān)，后者則呈正相關(guān)[18]。AFP是胎肝、再生肝及肝癌細胞所產(chǎn)生的一種癌胚蛋白，其量的多少反映肝細胞去分化程度的高低，是公認的肝癌腫瘤標志[19]。ALP是成熟肝細胞分泌的蛋白，可作為肝細胞分化的標記蛋白[20]。本研究結(jié)果提示，BrMC能誘導HepG2細胞分化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型。BrMC具有誘導人肝癌HepG2細胞分化的活性。

因此，本研究結(jié)果證實，傳統(tǒng)中藥蜂膠的有效成分白楊素的類似物BrMC能降低HepG2細胞核質(zhì)比、減少HepG2細胞的AFP分泌及有效地活化HepG2細胞TAT、ALP；且BrMC和ATRA均能抑制HepG2細胞γ-GT活性。BrMC通過以上作用誘導人肝癌細胞分化。但值得注意的是，分化的觀察指標應是一個綜合性指標，單獨觀察其中任一項指標，均無法證明腫瘤細胞的分化，而應綜合觀察細胞的形態(tài)、功能及生物學行為3個方面的指標。隨著腫瘤干細胞學說的提出，作者認為，腫瘤的本質(zhì)是一種干細胞疾病，于是設想BrMC可能首先是通過誘導肝癌干細胞分化，進而抑制肝癌干細胞自我更新，但尚有待于另外申報研究項目進行探索。

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Study on BrMC induced differentiation of human hepatocarcinoma HepG2 cells

He Guicheng，Yan Sijia，Ding En，Ai Xiaohong
（Department of Oncology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China）

ObjectiveTo evaluate whether the artificial semisynthetic analogue 8-bromo-7-methoxychrysin（BrMC），i. e.，8-nitrochrysin as an effective component of traditional Chinese medicine propolis，having the ability for inducing the differentiation of human hepatocarcinoma cells.MethodsThe human hepatocarcinoma HepG2 cells were cultured in vitro.The Wright s-Giemse mixed coloring method was adopted to detect the changes of the cellular morphology and the nuclear-cytoplasmic ratio of Hep G2 cells induced by BrMc；the changes of microtubules microfilament protein array of HepG2 cells induced by BrMC and all transretinoidacid（ATRA）wereobservedbyCoomassiebrilliantblue staining；the contentsof alkaline phosphatase（ALP）andgammaglutamyl transpeptidase（γ-GT）in HepG2 cells were detected by the enzyme catalyzed reaction；the radioimmunoassay（RIA）was used to detect the mass fraction of alpha fetal protein（AFP）；the content of tyrosine transaminase（TAT）was measured by the Diamondstone spectrophotometry.ResultsThe cytoplasmic ratio by 1.0 ug/mL BrMC handled was far lower than that of solvent con trol group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.1.0 μg/mL BrMC and ATRA handled 24，48，96 hours，the mass fraction of AFP，activity of γ-GT，ALP，TAT compared with the solvent control group respectively，the difference were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionBrMC induces human hepatocarcinoma cellular differentiation by lowing the nucleus-cytoplasmic ratio，decreasing the secretion of AFP，effectively activating TAT and ALP in HepG2 cells；moreover BrMc and ATRA inhibiting the activity of γ-GT.

Plantextracts； Liver neoplasms/pathology； Tumor cells，cultured； 8-bromo-7-methoxychrysin（BrMC）；HepG2cells； Differentiation； Induce

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.002

A

1009-5519（2015）19-2892-04

2015-05-05）

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本刊編輯部

湖南省中醫(yī)藥管理局項目（201140）。

何貴成（1987-），女，湖南衡陽人，碩士研究生，主要從事臨床實體瘤的診治與防治工作；Email：313397526@qq.com。

艾小紅（E-mail：1163504926@qq.com）。