不同濃度帕瑞昔布鈉預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷保護作用的研究

溫開蘭，楊孟昌，劉少星，謝先豐

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610072；2.成都市第二人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610017)

不同濃度帕瑞昔布鈉預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷保護作用的研究

溫開蘭1，楊孟昌1，劉少星2，謝先豐2

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610072；2.成都市第二人民醫(yī)院麻醉科，四川 成都 610017)

目的 探討不同濃度帕瑞昔布鈉預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護作用。方法 雄性SD大鼠128只，采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(S組)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(I/R組)、缺血再灌注+帕瑞昔布預(yù)處理組(P1、P2、P3、P4、P5、P6組)共8組，每組16只大鼠。線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)，缺血后2 h后再灌注24 h。在缺血前30 min，P1～P6組分別經(jīng)頸內(nèi)靜脈注入2、4、6、8、10、20 mg/kg帕瑞昔布鈉；S組和I/R組分別注入等容積生理鹽水。比較各組缺血2 h及再灌注24 h行神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死體積及體積百分比、缺血側(cè)額區(qū)皮質(zhì)中前列腺素E2(PGE2)含量。結(jié)果 P1～P6組神經(jīng)功能缺失評分、缺血再灌注后腦梗死體積、梗死體積百分比及PGE2含量均高于S組，但低于I/R組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。隨帕瑞昔布鈉濃度升高，P1～P6組神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死體積、腦梗死體積百分比及缺血側(cè)額區(qū)皮質(zhì)PGE2含量均逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P< 0.05)。結(jié)論 帕瑞昔布預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護作用，20 mg/kg保護作用最強。

帕瑞昔布；缺血-再灌注損傷；PGE2；預(yù)處理

缺血性腦血管病(ischemic cerebral vesscular disease，ICVD)致死率極高，是目前重點防治的一種疾病。在ICVD中，腦損傷持續(xù)發(fā)展，且缺血后炎癥反應(yīng)與延遲性腦損傷關(guān)系密切。帕瑞昔布為新型非甾體類藥物，是目前供臨床應(yīng)用的唯一注射用高選擇性環(huán)氧合酶2(COX-2)抑制劑，臨床上主要用來降低術(shù)后疼痛。治療濃度的帕瑞昔布可選擇性地抑制COX-2，抑制前列腺素類的合成，通過抑制腦缺血再灌注損傷中的免疫炎癥反應(yīng)途徑而發(fā)揮腦保護作用[1，2]。發(fā)揮鎮(zhèn)痛和抗炎作用時對COX-1抑制作用并不明顯，因而在發(fā)揮鎮(zhèn)痛及抗炎作用的同時，不影響胃黏膜、血小板及腎臟的功能。本研究利用線栓法制作大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)，觀察不同濃度帕瑞昔布對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的影響，探討帕瑞昔布發(fā)揮最大保護效應(yīng)的最適濃度，為臨床應(yīng)用研究提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠128只，SPF級，體重250～300 g，由四川省人民醫(yī)院動物中心提供。使用隨機數(shù)字表將其分為假手術(shù)組(S組)、單純?nèi)毖俟嘧⒔M(I/R組)、缺血再灌注+帕瑞昔布預(yù)處理組(P1、P2、P3、P4、P5、P6組)共8組，每組16只大鼠。

1.2 藥品、試劑及實驗儀器 帕瑞昔布(商品名：特耐)批號：85820004，輝瑞制藥有限公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)：上海醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；Sn-695B型免疫計數(shù)器，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MCAO 再灌注模型制備 參考Longa等文獻[1]，實驗開始前1 h行Longa神經(jīng)功能缺失評分，排除自身神經(jīng)功能缺陷大鼠。線栓法制作大鼠MCAO 再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，對鼠氣管插管后仰臥固定，分別游離出右側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、頸外動脈及左頸總靜脈，線栓(直徑0.23 mm，長度5 cm)經(jīng)頸外動脈進入通過頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈。進線栓長度為距頸總動脈分叉處18～20 mm，S組進線栓深度為10 mm。栓塞成功的大鼠(參考Longa等的5分評分法評分，2分及以上者入選本實驗)在缺血后2 h再次麻醉后拔線栓至頸外動脈殘端行再灌注。術(shù)中采用恒溫箱維持老鼠肛溫在36.5～37.0 ℃。術(shù)中插線栓次數(shù)大于3次、出血較多、取腦時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血及再灌注時間不足24小時死亡者剔除，并補足相應(yīng)例數(shù)。P1～P6組在缺血30分鐘前分別經(jīng)頸內(nèi)靜脈向向心端注入2、4、6、8、10、20 mg/kg帕瑞昔布注射液，而S組及I/R組給予等容積生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)檢查 于缺血2小時和拔出線栓行再灌注24小時進行神經(jīng)行為學(xué)檢查，按照Longa等5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分：無神經(jīng)功能缺損為0分；不能完全伸展左側(cè)前爪為1分；向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；：行走時向左側(cè)傾斜為3分；不能自發(fā)行走，有意識障礙為4分。

1.3.3 腦梗死體積測定 于再灌注24 h每組取8只大鼠，麻醉下迅速斷頭取腦組織，去除嗅球、小腦及低位腦干后，于-20 ℃冰箱中保存，行連續(xù)冠狀切片5片，片厚約2 mm，置于1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑(上海醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司)磷酸緩沖液中，37 ℃下避光孵育20 min，正常腦組織染成紅色，梗死區(qū)呈白色，置4%多聚甲醛固定，相同條件下拍照，病理圖像使用Image Pro Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)行分析，測定腦梗死體積和腦梗死體積百分比。

1.3.4 前列腺素E2(PGE2)含量的測定 各組中剩余大鼠于再灌注24 h再次麻醉后迅速斷頭取腦，取視交叉至漏斗柄腦片置10%甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片(5 μm)。HE染色后觀察海馬CA1區(qū)病理變化。同時在冰皿上迅速剝離右側(cè)大腦額區(qū)皮質(zhì)，精確稱重，以冷PBS制成25%腦組織勻漿，-70 ℃凍存。冰浴中孵化，置于1.5 ml離心管中，4 ℃、3000 rpm離心20 min取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定腦組織中PGE2水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組缺血再灌注不同時點神經(jīng)功能缺失評分 I/R組、P1～P6組神經(jīng)功能缺陷評分均高于S組(P< 0.05)；且P1～P6組低于I/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)見表1。隨帕瑞昔布鈉濃度升高，P1～P6組神經(jīng)功能缺陷評分逐漸降低，呈負(fù)相關(guān)(r=-0.613，P< 0.05)。

2.2 各組腦梗死體積、梗死體積百分比及再灌注24 h缺血側(cè)額區(qū)皮質(zhì)PGE2水平 I/R組、P1～P6組腦梗死體積及腦梗死體積百分比及缺血側(cè)額區(qū)皮質(zhì)PGE2含量均高于S組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)；且 P1～P6組低于I/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見表1。隨帕瑞昔布鈉濃度升高，P1～P6組腦梗死體積、腦梗死體積百分比及缺血側(cè)額區(qū)皮質(zhì)PGE2含量均逐漸降低，呈負(fù)相關(guān)(r=-0.875；r=-0.763；r=-0.687，均P< 0.05)。

3 討論

結(jié)合我們的前期研究以及相關(guān)文獻，已經(jīng)證實了帕瑞昔布的良好鎮(zhèn)痛作用以及其帕瑞昔布鈉預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷有保護作用：其保護作用從2 mg/kg開始出現(xiàn)，但在其濃度大于20 mg/kg之后可增大心血管系統(tǒng)及胃腸黏膜相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險，而在此濃度范圍內(nèi)尚未觀察到不良反應(yīng)，故本研究在此范圍觀察比較不同濃度的保護作用[2～5]。

表1 各組大鼠缺血再灌注各觀察指標(biāo)的比較

*與S組比較，P< 0.05；#與I/R組比較，P< 0.05；△與P1組比較，P< 0.05

在腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的免疫炎癥損傷的研究中，最新觀點認(rèn)為，白細(xì)胞浸潤所致的炎性反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。腦缺血再灌注損傷時，氧自由基等信使激活炎性細(xì)胞因子，使白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達上調(diào)，中性粒細(xì)胞向微血管內(nèi)皮細(xì)胞移動和黏附，致使中性粒細(xì)胞在缺血腦組織中浸潤引起損傷。研究顯示，非甾體類抗炎藥預(yù)處理可有效抑制腦缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)而起到一定的腦保護作用，關(guān)于其機制可能是通過抑制內(nèi)皮黏附分子的表達減輕再灌注后炎癥反應(yīng)而減少腦梗死面積[6～8]。COX-2是炎癥反應(yīng)過程中的重要因子，抑制COX-2過度表達和/或激活是對多種炎癥的有效治療手段之一[9]。PGE2為花生四烯酸代謝途徑中COX-2催化產(chǎn)物，為COX-2活性標(biāo)志物之一。PGE2通過增加星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用[10]。過度表達的TNF-α、IL-1β可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞間黏附分子，使白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附性增強，導(dǎo)致微血管遲發(fā)型低灌注并可誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進興奮性氨基酸，氧自由基等神經(jīng)毒性物質(zhì)的生成和釋放，造成腦水腫，加重炎性損傷[11]。

在大鼠腦缺血再灌注之后，腦組織內(nèi)的COX-2mRNA及COX-2蛋白含量明顯增加，使用COX-2抑制劑可使大鼠局灶性腦缺血再灌注腦梗死體積明顯縮小，并能通過抑制PGE2的增加，減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性壞死[12～14]。非甾體類抗炎藥帕瑞昔布鈉是全球第一種注射用高選擇性COX-2抑制劑，目前廣泛用于各類手術(shù)后疼痛的治療，故本研究選用帕瑞昔布鈉作為研究藥物。

線栓法制備的大鼠局灶性腦缺血模型可模擬臨床上常見的大腦中動脈供血區(qū)栓塞，因此本研究采用該方法制備腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血2 h進行再灌注的方法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，再灌注24 h時腦梗死體積較大，因此本研究以再灌注24 h作為觀察時點。結(jié)果表明，與S組比較，I/R組神經(jīng)功能缺失評分升高，且有腦梗死灶，提示腦缺血再灌注損傷模型制備成功。與I/R組比較，P1～P6組腦梗死體積及腦梗死體積百分比均降低，說明隨著帕瑞昔布濃度升高，其保護作用更明顯。本研究結(jié)果顯示：再灌注24 h后，PGE2含量顯著升高。帕瑞昔布預(yù)處理后腦組織中PGE2含量降低，且隨著帕瑞昔布鈉濃度升高預(yù)處理作用更明顯。

綜上所述，帕瑞昔布預(yù)處理能減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，降低腦梗體積及體積百分比，改善神經(jīng)功能，抑制炎性反應(yīng)，減輕缺血再灌注損傷，且20 mg/ml保護作用最佳。

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The protection effect of pretreatment with different doses of parecoxib for focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

WEN Kai-lan1，YANG Meng-chang1，LIU Shao-xing2，XIE Xian-feng2

(1.Department of Anesthesiology，Sichuan Academy of Medical Science and Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.Department of Anesthesiology，The 2ndPeople’s Hospital of Chengdu，Chengdu 610017，China)

YANGMeng-chang

Objective To investigate the protective effects of different concentration of parecoxib pretreatment on focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R)injury in rats.Methods One hundred and twenty eight male SD rats were randomly divided into sham operation group(group S)，simple focal cerebral I/R group(group I/R)and six focal cerebral I/R+ parecoxib pretreatment groups(group P1，P2，P3，P4 P5 and P6).Total were 8 groups，16 animals in each group.Rat middle cerebral artery ischemia model(MCAO)was set-up by using a suture-occluded method.Reperfusion was performed for 24 hours after 2 hour of ischemia.2，4，6，8，10，20 mg/kg of parecoxib were injected via inter jugular vein 30 min before ischemia in the groups P1～P6 while equal volume of saline was given in the group S and the group I/R.The neurological deficit scores(NDSs)were measured at 2 h after ischemia and at the end of 24 hours of reperfusion.The infarct volume and volume percentage were measured using TTC staining.Prostaglandin E2(PGE2)content in the ischemic frontal cortex was measured using a radioimmunoassay.Results The NDSs，the volume of cerebral infarcts and the percentage of cerebral infarcts，and the PGE2content in the groups P1～P6 were significantly higher than that in the group S but lower than that in the group I/R(all P < 0.05).These indexes were gradually decreased with the increasing doses of parecoxib when the group P1 to p6 were compared(allP< 0.05).Conclusion Pretreatment with parecoxib has protective effect on focal cerebral I/R injury in rats and it has strongest effect at 20 mg/kg.

Parecoxib；Ischemia-reperfusion injury；PGE2；Pretreatment

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(編號：100520)

楊孟昌

R322.81

A

1672-6170(2015)05-0074-04

2015-03-11；

2015-07-12)