布洛芬對兔骨關(guān)節(jié)炎模型Wnt/β-catenin信號通路和軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響

劉洪彥，鄭 毅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100020)

布洛芬對兔骨關(guān)節(jié)炎模型Wnt/β-catenin信號通路和軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響

劉洪彥，鄭 毅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100020)

目的 探討布洛芬對兔骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)模型膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝及Wnt/β-catenin信號通路的影響。方法 采用改良伸直位固定法制作兔OA模型，分離提取兔OA模型膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。采用四唑鹽比色法選擇布洛芬和二甲基亞砜(DMSO)實(shí)驗(yàn)濃度。確定實(shí)驗(yàn)濃度后將軟骨細(xì)胞分為DMSO組和布洛芬組，分別給予1%DMSO和250 μM布洛芬干預(yù)48 h后，采用real-time PCR法和ELISA方法檢測軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin相關(guān)因子(β-catenin、MMP-13、ADAMTS-4、II型膠原和蛋白聚糖)mRNA及蛋白的水平。結(jié)果 DMSO對照組和布洛芬組β-catenin、MMP-13、ADAMTS-4、II型膠原和蛋白聚糖的mRNA及蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 兔OA模型膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，布洛芬對Wnt/β-catenin信號通路和軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝無明顯影響。

骨關(guān)節(jié)炎；Wnt/β-catenin信號通路；基質(zhì)代謝；布洛芬

骨關(guān)節(jié)炎是(osteoarthritis，OA)是一種由多種原因所致的慢性退行性關(guān)節(jié)病變。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路是參與骨和軟骨代謝的重要信號通路，在OA中發(fā)揮重要作用。另有研究顯示，非甾體類抗炎藥(NSAIDs)可通過抑制Wnt信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，而此通路下游基因和蛋白表達(dá)可影響關(guān)節(jié)軟骨生長代謝，在OA發(fā)生發(fā)展中有重要作用[1，2]。據(jù)此提出假設(shè)，在OA中，NSAIDs可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路對OA軟骨細(xì)胞代謝發(fā)揮作用。為驗(yàn)證此假說，本研究以布洛芬為例進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 6月齡健康普通級新西蘭大耳兔8只(北京房山動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供)，雄性，體重2～2.5 kg，復(fù)合飼料喂養(yǎng)。DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，Hyclone公司；胎牛血清，元亨生物公司；TRIZOL，Invitrogen life technologies公司；RNAsimple總RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；cDNA合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒，加拿大MBI Fermentas公司；SYBR Green PCR Master Mix，美國Applied Biosystems公司；ELISA試劑盒，武漢華美。一抗和二抗，北京博奧森生物有限公司。

1.2 細(xì)胞準(zhǔn)備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用改良伸直位固定法[3]制作兔OA模型，造模7周。造模完成后處死家兔，無菌條件下取造模膝關(guān)節(jié)軟骨組織，應(yīng)用分階段酶消化法分離軟骨細(xì)胞，用含20%FBS的DMEM-F12，37 ℃，5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 藥物濃度選擇 取生長良好的第二代OA軟骨細(xì)胞，分為正常對照組、DMSO組和布洛芬組。正常對照組不予處理，DMSO和布洛芬組設(shè)置高中低三種藥物濃度梯度，分別為DMSO 1%、0.1%與0.01%，布洛芬1000、500、250 μM，參照試劑盒說明書，應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色法檢測各濃度梯度內(nèi)對兔OA軟骨細(xì)胞活性的影響。取不同兔的第二代軟骨細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)1次，計(jì)算2次實(shí)驗(yàn)中每種藥物濃度組光吸收值的平均值。

與正常對照組(0.162±0.014)相比，高濃度和中濃度布洛芬組光吸收值(OD值)明顯降低(P< 0.05)，而不同濃度DMSO組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，結(jié)果見表1。參考文獻(xiàn)，選擇對細(xì)胞無明顯毒性作用并與血藥濃度相近的較高藥物濃度進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。故最終選擇布洛芬250 μM和DMSO 1%為實(shí)驗(yàn)濃度。

表1 布洛芬對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活性的影響

*與對照組相比，P< 0.05

1.4 ELISA方法檢測蛋白水平 將軟骨細(xì)胞分為DMSO組和布洛芬組。取二代OA軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入選擇實(shí)驗(yàn)濃度的DMSO和布洛芬培養(yǎng)48 h。取細(xì)胞上清液采用ELISA方法檢測蛋白水平，具體步驟嚴(yán)格按ELISA說明書進(jìn)行。

1.5 RT-PCR方法檢測基因水平 兩組細(xì)胞經(jīng)DMSO和布洛芬干預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)后棄上清液，用PBS清洗2遍后，加入1 ml TRIZOL反復(fù)吹打，參照試劑說明書完成RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)如表2。應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix在7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR，檢測各因子mRNA水平。實(shí)驗(yàn)中所有樣本均設(shè)三復(fù)孔。反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，Primer 1(10 μM)1 μl，Primer 2(10 μM)1 μl，2×SYBR Green qPCR Mix 5 μl，dd H2O 1 μl。反應(yīng)條件：50 ℃，2 min； 94 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；60 ℃，1 min 30個(gè)循環(huán)。獲得擴(kuò)增曲線和溶解曲線。mRNA相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算，ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)。CT值代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

表2 Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 布洛芬對兔OA軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響 與DMSO組相比，布洛芬組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。與DMSO組相比，布洛芬組軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見表3。

表3 布洛芬對OA軟骨細(xì)胞上清液中軟骨基質(zhì)蛋白的影響

2.2 兩組Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子mRNA及蛋白水平的比較

2.2.1 兩組β-catenin mRNA及蛋白水平的比較 兩組軟骨細(xì)胞內(nèi)β-catenin mRNA和β-catenin蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(圖1)。兩組軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-13及MMP-13蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見圖2。

2.2.2 兩組MMP-13 mRNA及蛋白水平的比較

2.2.3 兩組ADAMTS-4 mRNA及蛋白水平的比較 兩組軟骨細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-4蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見圖3。

圖1 兩組兔OA軟骨細(xì)胞內(nèi)β-catenin mRNA和蛋白相對表達(dá)量 a：mRNA；b：蛋白水平

圖2 兩組兔OA軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-13 mRNA和蛋白相對表達(dá)量 a：mRNA；b：蛋白水平

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路在OA中發(fā)揮著重要作用，它與骨組織細(xì)胞分化、生長、凋亡、死亡、骨量調(diào)節(jié)等多個(gè)病理生理過程有關(guān)[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路的異常使骨骼系統(tǒng)代謝失衡，可導(dǎo)致OA的發(fā)生[6]，此信號通路靶基因包括參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和基質(zhì)代謝的基因，其中包括MMPs、ADAMTS等，對OA軟骨代謝具有重要作用[7，8]。

圖3 兩組兔OA軟骨細(xì)胞ADAMTS-4 mRNA及蛋白相對表達(dá)量 a：mRNA；b：蛋白水平

NSAIDs作為緩解OA癥狀的重要藥物，NSAIDs主要作用機(jī)制是抑制環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)活性，減少炎癥因子前列腺素的合成，從而減輕或控制炎癥反應(yīng)。根據(jù)對COX-1和COX-2的選擇性，分為非選擇性NSAIDs和選擇性NSAIDs，前者同時(shí)抑制COX-1和COX-2，而后者更有針對性地抑制COX-2。本實(shí)驗(yàn)中研究用藥布洛芬屬于非選擇性COX抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，NSAIDs可通過抑制Wnt/β-catenin通路發(fā)揮腫瘤預(yù)防作用[9，10]，而其下游靶基因在OA軟骨代謝中發(fā)揮重要作用。那么，NSAIDs對軟骨的作用是否能夠通過Wnt/β-catenin來調(diào)節(jié)，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究從細(xì)胞水平探討布洛芬對軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的作用以及Wnt/β-catenin信號通路在其中可能發(fā)揮的作用。

本研究分別采用布洛芬250 、500、1000 μM進(jìn)行藥物毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后兩者均對OA軟骨細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒性作用，故選擇布洛芬250 μM為最終濃度。另外，由于所選擇的實(shí)驗(yàn)用藥布洛芬在合成過程中添加了DMSO溶劑，為了排除DMSO對實(shí)驗(yàn)的干擾，對DMSO在濃度為0.01%、0.1%和1%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度DMSO對OA軟骨細(xì)胞的活性均無影響。由于藥物中DMSO的濃度更接近1%，故以此為對照，以排除后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DMSO的干擾。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)布洛芬干預(yù)后，OA軟骨細(xì)胞內(nèi)II型膠原和蛋白聚糖無明顯變化。提示布洛芬對兔OA軟骨基質(zhì)代謝無明顯影響。臨床上，布洛芬廣泛用于緩解OA疼痛癥狀。有個(gè)別研究顯示布洛芬對軟骨基質(zhì)代謝具有抑制作用[11]，這使得臨床醫(yī)生在應(yīng)用布洛芬治療OA時(shí)產(chǎn)生了遲疑。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)布洛芬對軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝并無抑制作用，為布洛芬治療OA的臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)布洛芬干預(yù)后，軟骨細(xì)胞內(nèi)β-catenin基因和蛋白及其下游因子MMP-13、ADAMTS-4均無明顯變化。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵因素。存在Wnt信號時(shí)，β-catenin在細(xì)胞漿中積累，累積到一定量即進(jìn)入核內(nèi)與Lef/Tcf結(jié)合可激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。β-catenin在細(xì)胞漿內(nèi)水平的高低和核內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況提示了Wnt/β-catenin信號通路的狀態(tài)。Wnt/β-catenin通路下游因子MMP-13和ADAMTS-4是與軟骨基質(zhì)代謝密切相關(guān)的因子，前者主要對軟骨基質(zhì)II型膠原具有促分解作用，而后者主要對蛋白聚糖具有分解作用。此實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)布洛芬干預(yù)后β-catenin基因和蛋白均無明顯變化，其下游因子亦無明顯變化，恰與軟骨基質(zhì)II型膠原和蛋白聚糖未發(fā)生變化的結(jié)果吻合。上述結(jié)果均提示，在OA軟骨細(xì)胞中布洛芬對Wnt/β-catenin信號通路無抑制作用，這與NSAIDs在腫瘤中的研究結(jié)果不一致。Greenspan等[12]用布洛芬干預(yù)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，布洛芬可抑制細(xì)胞中β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，抑制下游靶基因cyclin D1的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。而本實(shí)驗(yàn)在OA中的研究并未發(fā)現(xiàn)布洛芬對Wnt信號通路的抑制作用。Gareddy在人膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的研究也發(fā)現(xiàn)NSAIDs塞來昔布可通過抑制Wnt信號通路而抑制人膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長。我們認(rèn)為OA軟骨細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中研究結(jié)果出現(xiàn)不一致的原因可能如下：①組織細(xì)胞差異性。目前NSAIDs對Wnt信號通路的抑制研究僅局限于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)在其它組織或細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)獻(xiàn)報(bào)道。腫瘤細(xì)胞作為人體內(nèi)的異常變異的細(xì)胞，其在信號通路方面的特殊性可能是導(dǎo)致在OA軟骨細(xì)胞中研究與腫瘤細(xì)胞內(nèi)研究結(jié)果不一致的原因。②COX-2的依賴性。Smith等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，紫外線誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)與PGE2增加導(dǎo)致β-catenin信號通路的激活，最新研究顯示[14]COX-2抑制劑的應(yīng)用可以顯著抑制紫外線誘發(fā)的β-catenin活化，在NSAIDs通過抑制β-catenin信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)，羅非昔布等COX-2特異性抑制劑較COX非特異性抑制劑作用更為顯著[15]，上述結(jié)果均提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路是具有COX-2依賴性的。本實(shí)驗(yàn)中選擇布洛芬為研究藥物，它是一種非選擇性COX抑制劑，對COX-2的抑制作用較弱，這可能是OA中布洛芬未表現(xiàn)出Wnt/β-catenin信號通路抑制性的原因之一。

綜上所述，布洛芬對OA中軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝無明顯影響，為臨床醫(yī)生應(yīng)用布洛芬治療OA提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。另外，布洛芬對Wnt/β-catenin信號通路亦無明顯抑制作用，這可能是與NSAIDs對Wnt/信號通路的抑制作用具有COX-2依賴性有關(guān)。

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The role of ibuprofen to Wnt signaling pathway and chondrocytes matrix metabolism in osteoarthritis

LIU Hong-yan，ZHENG Yi

(Department of Rheumatology and Immunology，Beijing Chao-yang Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100020，China)

ZHENGYi

Objective To study the metabolism how ibuprofen influence matrix metabolism of rabbit OA chondrocytes and the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in this process.Methods Use a modified way of mechanical fixation to make rabbit OA model，separation and extraction of rabbit knee OA chondrocytes and then culture in medium.MTT was used to select the dose of DMSO and ibuprofen.After that，the cultured chondroctyes were divided into nomral control group and ibuprofen group，use ELISA and real-time PCR to detect the protein and gene expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related factors including β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，collagen II，proteoglycan.Results There were no differences between normal group and ibuprofen group of Wnt/β-catenin signaling pathway related factors including β-catenin，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，collagen II and proteoglycan.Conclusion In rabbit OA knee chondrocytes，ibuprofen has no effect on matrix metabolism and Wnt/β-catenin signaling pathway.

Osteoarthritis； Wnt /β-catenin signaling pathway； Matrix metabolism； Ibuprofen

R593.2

A

1672-6170(2015)05-0057-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：81172855)

鄭 毅，女，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師。中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病分會(huì)委員，中國醫(yī)師協(xié)會(huì)風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會(huì)常務(wù)委員，中國醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)科培訓(xùn)專業(yè)指導(dǎo)委員會(huì)主任委員，海峽兩岸醫(yī)藥衛(wèi)生交流協(xié)會(huì)風(fēng)濕病專家委員會(huì)副主任委員，北京醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病分會(huì)副主任委員，北京醫(yī)師協(xié)會(huì)風(fēng)濕免疫?？漆t(yī)師分會(huì)副會(huì)長。普通高等教育國家級規(guī)劃教材、衛(wèi)生部規(guī)劃教材5年制和8年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)《內(nèi)科學(xué)》編委。主要研究方向：風(fēng)濕性疾病診治。

2015-05-14)