五味子多糖的分離純化之技術(shù)概論

杜萍 冮怡琳 王旭 畢珊珊 邢光民

隨著我國(guó)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)的植物提純技術(shù)已經(jīng)取得了重要的成果。已經(jīng)應(yīng)用到醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。五味子由于其果實(shí)中含有甘、酸、辛、苦、咸等五種味道，同時(shí)又由于其生長(zhǎng)在我國(guó)的東北地區(qū)因此也被成為北五味子。北五味子是一種木蘭科植物，他還被稱為五梅子、山花椒、玄及等等。由于北五味子內(nèi)含有一定的多糖、木脂素、揮發(fā)油、具有一定的滋補(bǔ)作用因此也是我國(guó)重要的重要滋補(bǔ)材料具有較高的醫(yī)療保健作用和很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于北五味子具有較高的營(yíng)養(yǎng)醫(yī)療價(jià)值因此在當(dāng)今的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有極高的研究?jī)r(jià)值，但是目前我國(guó)對(duì)于北五味子果實(shí)內(nèi)部含有的多糖、木脂素、揮發(fā)油的提取分離提純等技術(shù)還不夠成熟，因此為了更好的利用北五味子需要我們針對(duì)北五味子提純技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，下文對(duì)北五味子多糖提純技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，目的是為更好的將北五味子進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值轉(zhuǎn)換。

1、材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 提純北五味子時(shí)使用的五味子是經(jīng)過人工進(jìn)行培育養(yǎng)植的，這可以保證北五味子的質(zhì)量。北五味子要經(jīng)過干燥、清洗、烘干后備用。使用的化學(xué)材料主要有無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、三氯甲烷苯酚、木瓜蛋白酶等等。同時(shí)還有分析純；DEAE一52纖維素；SephadexS一300：

1.1.2 儀器與設(shè)備

五味子的多糖提純研究過程中需要一定的機(jī)器設(shè)備來幫助完成，其中包括了以下的幾種設(shè)備。主要有可見分光光度儀，RE一52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍離心機(jī)，紫外可見分光光度儀，SHZ—IIIB型循環(huán)水真空泵，TDL一5000B型冷凍離心機(jī)，V一1100紫外可見分光光度計(jì)，透析袋(分子截流量為1000U)，BSZ一100自動(dòng)部分收集器，HL一2恒流泵，TDL一5000B型離心機(jī)，Sar—trius分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖的制備

用蒸餾水將五味子在大燒杯中浸泡24小時(shí)，然后用50克的試用材料對(duì)其進(jìn)行水提實(shí)驗(yàn)，這里需要注意的是水提正交實(shí)驗(yàn)是需要用壓濾器對(duì)其中的濾液進(jìn)行過濾處理的，只有將濾液的濃度濃縮到一定的體積之后，在運(yùn)用五倍的乙醇對(duì)其進(jìn)行沉淀處理，在放置一天之后，設(shè)置6000r／分鐘后使用離心機(jī)離心20rain，60攝氏度干燥以后對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行稱量。此時(shí)還要用苯酚硫酸來測(cè)定一下多糖的實(shí)際含量。

1.2.2 粗多糖脫蛋白處理

我們的研究人員運(yùn)用三氯乙酸法對(duì)五味子進(jìn)行了脫蛋白的處理，再處理的過程當(dāng)中需要注意，只要將中間層沒有出現(xiàn)變性的蛋白就可以了。這里用馬斯亮蘭法檢測(cè)蛋白含量，然后再用蒸餾水將多糖逐漸的進(jìn)行透析，一般透析的時(shí)間在兩天左右的時(shí)間，在經(jīng)過濃縮和沉淀之后，就可以得到黃色或者是微黃色的多糖化合物。

1.2.3 五味子均一多糖制備及純度鑒定

使用pH為6.8的蒸餾水浸泡已經(jīng)處理好的填充材料，裝柱(30emxlcm)后緩沖液平衡12小時(shí)，將上部分的樣液：50mg蒸餾水溶解的多糖濃縮液至6mL，接下來分別使用蒸餾水：0.1mol／LNaC1、0.2mol／LNaC1、0.3mol／LNaC1溶液反復(fù)洗脫，每5分鐘收集一管，5mL／管。最終收集相同鋒味以及相關(guān)的透析，最后進(jìn)行凍干處理。

而對(duì)于多糖的柱層析：主要是將溶脹好的填充料用0.1mol／L的NaC1溶液平衡12小時(shí)，在上樣之后會(huì)使用相同的例子濃度對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的洗脫處理，再收集了相同的鋒味之后，我們?cè)谥v多糖的水溶液在紫外線分光光度計(jì)的波長(zhǎng)上進(jìn)行相應(yīng)的掃描。收集相同峰位后，透析，濃縮，凍干。將多糖配成1mg／mL的水溶液在紫外分光光度計(jì)200～400nm波長(zhǎng)上掃描。

2、結(jié)果

2.1 不同方法對(duì)蛋白脫除的結(jié)果與討論

使用不一樣的方法對(duì)蛋白脫除的結(jié)果可以明顯看出，與sevage法相比較三氯乙酸法的效果更加明顯并且結(jié)果較為可觀。綜合酶法與以上兩種方法相比較，三氯乙酸法與酶脫蛋白質(zhì)的效果還是很好的，因此我們的研究人員可以使用這一方法來對(duì)其進(jìn)行脫蛋白處理，一般情況下反復(fù)5次便可以了，這個(gè)時(shí)候蛋白質(zhì)含量為0.91mg／g；可以酶法與Sevag法結(jié)合時(shí)，酶解處理后，經(jīng)過7次Sevag法處理，蛋白質(zhì)含量仍為1.633mg／g，可見效果不太理想。

2.2 五味子多糖組分分離結(jié)果與討論

我們使用DEAE—cellulose52層析柱將五味子多糖進(jìn)行不同組分分離：多糖上樣后，分別用水0.1mol／LNaC1、0.2NaC1、0.3mol／LNaC1反復(fù)洗脫直到硫酸一苯酚顯現(xiàn)陰性為止，結(jié)果出現(xiàn)一個(gè)水洗峰A，以及B1、B2、B3，共計(jì)3個(gè)鹽洗峰，分別出現(xiàn)在0.1mol／L、0.2mol／L、0.3mol／L鹽洗脫100mL以后。我們可以從多糖的洗脫曲線看出，水洗峰A含量特別少，而SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII含量相對(duì)特別高。在這里水洗多糖組分是一種透明的液體，鹽洗脫組分SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII呈現(xiàn)出不同程度的黃色。

結(jié)論

我們的研究人員發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)多糖脫蛋白的過程當(dāng)中，酶法與三氯乙酸相結(jié)合的效果機(jī)械能脫白其實(shí)是最好的，我們?cè)诮?jīng)過了酶解處理，再經(jīng)三氯乙酸一正丁醇法脫蛋白反復(fù)處理5次便可以了，這個(gè)時(shí)候蛋白質(zhì)含量是0.91mg／g，很明顯這個(gè)方法相對(duì)最好。但是酶法與Sevag法結(jié)合時(shí)，酶解處理以后，經(jīng)過了7次的Sevag法處理，蛋白質(zhì)含量依舊是1.633mg／g，可見這種方法的脫蛋白效率依舊比較差。經(jīng)過了DEAE—cellulose52層析柱吸附解析，將多糖分離成3種多糖組分SCP—BI、SCP—BII、SCP—BIII；經(jīng)SephadexS-300凝膠柱層析后，同樣都是對(duì)稱并且單一的峰；經(jīng)過紫外光譜的分析，SCP-BI、SCP-BII、SCP_BIII在280、260nm處沒有無吸收，這就證明它不含蛋白、多肽及核酸。于是就可以更確切證明SCP-BI、SCP-BII、SCP-B111多糖為均一組分。