制何首烏水提液對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖、分化及OPG-RANKL mRNA表達的影響

范迎賽，李 琴，高宗勤，范 開，劉鐘杰

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

制何首烏為蓼科植物何首烏（PolygonummultiflorumThunb.）干燥塊根的炮制加工品，味苦、甘、澀，性微溫，歸肝、心、腎經(jīng)，具有補肝腎、益精血、壯筋骨的功效［1］。制何首烏對骨質(zhì)疏松癥具有一定的防治作用［2］，但其調(diào)節(jié)骨代謝的作用機制尚不清楚。

骨代謝活動包括成骨細胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)沉積與破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收，骨吸收大于骨沉積即易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松［3］。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是成骨細胞分化成熟的早期標志之一［4］，與骨基質(zhì)形成密切相關(guān)［5］；骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和 核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）是成骨細胞調(diào)節(jié)破骨細胞增殖分化的重要因子，與骨吸收活動相聯(lián)系［6］。本試驗通過研究不同濃度制何首烏水提液對體外培養(yǎng)小鼠成骨細胞 MC3T3-E1增殖、ALP分泌和 OPG／RANKL mRNA 表達的影響，探索制何首烏調(diào)節(jié)骨代謝可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及主要試劑 制何首烏飲片為北京同仁堂馬連洼藥店產(chǎn)品；α-MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素溶液為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為Gibico公司產(chǎn)品；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶（ALP）活力檢測試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品；細胞RNA提取試劑盒為艾德萊公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、p-EASY-T3Cloning Kit、質(zhì)粒 DNA 小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、qPCR試劑為全式金公司產(chǎn)品。

1.1.2 細胞株 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 制何首烏水提液的制備 取100g制何首烏飲片常規(guī)煎煮2次，濃縮至1g／mL，置-20℃保存?zhèn)溆?。用前過濾除菌，使用含50mL／L FBS的α-MEM培養(yǎng)基配制為不同濃度的制何首烏培養(yǎng)液（0、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8g／mL）。

1.2.2 MC3T3-E1細胞相對增殖率的檢測 將MC3T3-E1細胞接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，隨機分組，將細胞分別作用于100μL不同濃度的制何首烏培養(yǎng)液中。加藥44h或68h后于各孔加入30μL 5g／mL MTT，4h后棄去培養(yǎng)液，于各孔加入150μL DMSO，避光振蕩混勻15min，于酶標儀570nm處檢測OD值。細胞相對增殖率＝試驗組OD值／對照組OD值×100% 。

1.2.3 MC3T3-E1細胞ALP蛋白表達的檢測 細胞培養(yǎng)同1.2.2，加藥2d及6d后，收集細胞上清，按照ALP活力檢測試劑盒（微板法）說明書進行操作。其原理為ALP可分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生的游離酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，可于酶標儀520nm波長下進行檢測。細胞培養(yǎng)液中ALP活力＝（試驗組OD值／對照組OD值）×標準品濃度（0.1mg／mL）×100mL

1.2.4 MC3T3-E1細胞 OPG、RANKL mRNA 表達的檢測

1.2.4.1 標準曲線的制備 按照說明書進行MC3T3-E1細胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄，PCR產(chǎn)物跑膠及切膠回收，載體連接、轉(zhuǎn)化和菌株測序。提取測序陽性菌質(zhì)粒，分別10倍遞增稀釋8組，采用熒光PCR三步法制作標準曲線。普通PCR及熒光PCR退火溫度均為60℃，引物序列見表1。

表1 MC3T3-E1細胞OPG、RANKL和β-actin引物序列Table 1 Sequence of primers of OPG，RANKL andβ-actin for MC3T3-E1cells

1.2.4.2 OPG、RANKL mRNA 表達的檢測 將MC3T3-E1細胞接種于6孔板，待細胞完全貼壁后，將細胞分別作用于4mL不同濃度的制何首烏培養(yǎng)液中。1d后，按照說明書提取細胞總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用實時定量PCR三步法對不同處理組樣本OPG、RANKL和β-actin基因進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 MC3T3-E1細胞增殖

MC3T3-E1細胞增殖率檢測結(jié)果見圖1。藥物作用2d及3d后，10-4～10-8g／mL濃度制何首烏水提液均可極顯著促進MC3T3-E1細胞增殖（P＜0.01）。

圖1 不同濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細胞增殖率的影響（n＝5）Fig.1 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on proliferation rate of MC3T3-E1cells（n＝5）

2.2 MC3T3-E1細胞ALP蛋白的表達

MC3T3-E1細胞ALP蛋白表達檢測結(jié)果見圖2。藥物作用2d后，10-4g／mL濃度制何首烏水提液可顯著促進MC3T3-E1細胞分泌ALP蛋白（P＜0.05），10-5和10-6g／mL 濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細胞分泌ALP蛋白無明顯影響（P＞0.05）；作用6d后，10-4、10-5、10-6g／mL濃度制何首烏水提液均可極顯著促進MC3T3-E1細胞分泌ALP蛋白（P＜0.01）。

圖2 不同濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細胞分泌ALP的影響（n＝3）Fig.2 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on ALP secretion of MC3T3-E1cells（n＝3）

2.3 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.3.1 PCR標準曲線 目的基因PCR擴增產(chǎn)物與目的片段大小相符，陽性克隆測序結(jié)果與原始序列100%同源；目的基因熒光PCR擴增產(chǎn)物溶解曲線主峰單一，無異常增寬，說明引物特異性良好；OPG和RANKL標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.998 0與0.999 0，說明設(shè)計引物擴增效率一致。

2.3.2 OPG、RANKL mRNA表達的檢測 OPG、RANKL mRNA表達的檢測結(jié)果見圖3。藥物作用1d后，10-4g／mL濃度制何首烏水提液可顯著提高MC3T3-E1細胞OPG／RANKL mRNA表達比（P＜0.05），10-5g／mL 濃度制何首烏水提液可極顯著提高 MC3T3-E1細胞 OPG／RANKL mRNA表達比（P＜0.01），10-6、10-7、10-8g／mL濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細胞OPG／RANKL mRNA表達比無明顯影響 （P＞0.05）。

圖3 不同濃度制何首烏水提液對MC3T3-E1細胞OPG／RANKL mRNA 比值的影響（n＝3）Fig.3 Effect of different concentrations of Radix Polygoni Multiflori Preparata water extracts on OPG／RANKL mRNA ratio of MC3T3-E1cells（n＝3）

3 討論

骨基質(zhì)沉積包括成骨細胞分化增殖、基質(zhì)形成和基質(zhì)鈣化3個時期，ALP活性增高是成骨細胞分化的早期標志和骨基質(zhì)形成期的特征性表現(xiàn)［4］。MTT檢測結(jié)果顯示，各濃度制何首烏水提液作用MC3T3-E1細胞2d～3d后均可極顯著上調(diào)細胞增殖率，說明制何首烏水提液具有促進細胞增殖的作用。ALP檢測結(jié)果顯示，制何首烏水提液作用細胞2d后，高濃度可顯著促進MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中ALP活力，低濃度無明顯作用，說明高濃度制何首烏水提液具有促MC3T3-E1細胞分化的作用；作用細胞6d后，各濃度均可極顯著促進MC3T3-E1細胞培養(yǎng)上清中ALP活力，說明隨著時間的延長，低濃度的制何首烏水提液也發(fā)揮出促MC3T3-E1細胞分化的作用。

破骨細胞是動物機體唯一專職骨吸收的細胞［7］，成骨細胞通過分泌OPG和RANKL調(diào)控破骨細胞活動［8］。RANKL與破骨祖細胞表面的核因子κB受體活化因子（RANK）結(jié)合后，募集和激活細胞質(zhì)內(nèi)腫瘤壞死因子相關(guān)因子，促進破骨祖細胞分化為破骨細胞［9］，提高破骨細胞骨吸收活性［6］。OPG屬于腫瘤壞死因子受體超家族，可結(jié)合RANKL并抑制其通過結(jié)合RANK發(fā)揮的促進破骨細胞增殖分化的作用，從而抑制骨吸收［10］。熒光定量PCR結(jié)果顯示，高濃度制何首烏水提液能夠提高MC3T3-E1細胞OPG／RANKL mRNA表達比，說明高濃度的制何首烏水提液可能通過上調(diào)成骨細胞OPG／RANKL表達比的途徑抑制破骨細胞增殖分化。有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的制何首烏醇提物可抑制體外培養(yǎng)大鼠破骨細胞增殖及分化［11］，推測制何首烏可通過直接作用于破骨細胞和成骨細胞分泌細胞因子間接作用于破骨細胞兩個途徑抑制破骨細胞增殖分化。

制何首烏的化學(xué)成份主要有蒽醌類化合物（大黃酚、大黃素、大黃酸等）、二苯乙烯苷類化合物、黃酮類化合物、磷脂類化合物和多糖等［12］，有研究發(fā)現(xiàn)何首烏、大黃素和二苯乙烯苷均具有雌激素樣作用［13］。雌激素具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，可以促進成骨細胞增殖、ALP活性和OPG／RANKL mRNA表達比［14］。本試驗中，高濃度制何首烏對 MC3T3-E1細胞的作用是否與其具雌激素樣作用的成份相關(guān)，需要進一步的研究。

綜上所述，一定濃度的制何首烏具有促進成骨細胞增殖分化和抑制破骨細胞增殖分化的作用，產(chǎn)生作用的分子機制與ALP及OPG／RANKL系統(tǒng)相關(guān)。

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