α-硫辛酸對Marc-145細胞感染高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒后氧化應(yīng)激的影響

張 浩，胡蓮美，邱先帥，肖熹玉，任常寶，唐兆新，＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶 526238）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性接觸性傳染病。2006年6月起，“豬高熱綜合癥”在我國南方部分省份暴發(fā)，并在全國大范圍流行，經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查、病毒分離、基因分析和動物試驗等，確定為PRRSV變異株造成，并將變異株命名為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HPPRRSV）［1］。許多學(xué)者進行了病毒對細胞作用機制的深入研究。研究表明，病毒感染可以引起機體內(nèi)細胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的釋放，ROS可以使細胞膜磷脂層發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，ROS被認為是病毒性疾病病理過程中引起細胞損傷的元兇［2-3］。

α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，LA）是一類維生素，有很強的抗氧化活性，被譽為“萬能抗氧化劑”［4］。LA具有很強的清除自由基和活性氧能力［5］，0.05mmol／L～1mmol／L濃度的 LA 可以清除羥基自由基、次氯酸［6］。同時LA可以通過增強細胞內(nèi)半胱氨酸的有效性來提高谷胱甘肽（L-glutathione，GSH）的濃度。本研究以HP-PRRSV感染Marc-145細胞為模型，通過測定過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）的含量及超氧化物歧化酶（super-oxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶 （catalase，CAT）兩種抗氧化酶的活力，研究α-硫辛酸對Marc-145細胞感染高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒后細胞內(nèi)抗氧化功能的影響，探討HP-PRRSV對Marc-145細胞抗氧化功能的損傷機制和α-硫辛酸對HP-PRRSV的抑制機制，為HP-PRRSV臨床病理研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 Marc-145細胞和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（NVDC-JXA1株）由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司重點實驗室提供，病毒TCID50為107.5／0.1mL。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為Gibico公司產(chǎn)品；過氧化氫、SOD、CAT、MDA檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；MTT為Sigma公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為Revco公司產(chǎn)品；6孔培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與病毒增殖 Marc-145細胞用含100mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中。待細胞長成單層，接種 HP-PRRSV，37℃孵育1h，加入含有20mL／L的胎牛血清的DMEM維持液，待細胞病變達到80%時收獲病毒，反復(fù)凍融3次，待細胞完全脫落，離心收集上清，分裝，置-80℃保存。

1.2.2 細胞分組處理 將生長狀況良好的Marc-145細胞以2mL／孔（約1.8×106個）接種到六孔培養(yǎng)板。待細胞形成單層，將細胞分為4組，即正常細胞對照組NC組（細胞維持液）、病毒組D組（含10-3×TCID50病毒液的維持液）、α-硫辛酸干預(yù)病毒組DLA組（10-3×TCID50病毒液和250μmol／Lα-硫辛酸的維持液）、α-硫辛酸干預(yù)組 LA 組（含250μmol／Lα-硫辛酸的維持液）。

1.2.3 細胞氧化應(yīng)激檢測試驗 將4組細胞分別接種在六孔板后，每個時間段各設(shè)置2個重復(fù)組，分別在2、12、24、36、48h收集細胞，置低溫冰箱反復(fù)凍融，取上清液，按試劑盒說明書測定H2O2含量、MDA含量、SOD活力和CAT活力，每孔復(fù)測3次。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 試驗數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件單因素分析程序分析各組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Marc-145細胞內(nèi)H2O2含量的變化

結(jié)果見表1。由表1可知，試驗進行12h時，D組和DLA組細胞內(nèi)H2O2含量顯著高于NC組和LA組（P＜0.05）。24h時，D組和DLA組細胞內(nèi)H2O2含量迅速增加，顯著高于NC組和LA組（P＜0.05）。LA組細胞內(nèi) H2O2含量顯著低于其他3組（P＜0.05）。36h和48h時，D組細胞內(nèi)H2O2含量顯著高于其他3組（P＜0.05），DLA組細胞內(nèi)H2O2含量顯著低于D組，而顯著高于NC組和LA組（P＜0.05）。

表1 Marc-145細胞內(nèi)H2O2含量檢測結(jié)果Table 1 The detection of H2O2in Marc-145cells mmol／L

2.2 Marc-145細胞內(nèi)MDA含量的變化

結(jié)果見表2。由表2可知，在試驗進行24h時，D組和DLA組細胞內(nèi)MDA含量顯著高于NC組和LA組細胞（P＜0.05），LA組細胞內(nèi) MDA含量顯著低于其他3組（P＜0.05）。試驗進行36h時，D組細胞內(nèi)MDA含量顯著高于其他3組（P＜0.05）；DLA組細胞內(nèi)MDA含量顯著低于D組，同時顯著高于LA組（P＜0.05）；LA組細胞內(nèi) MDA含量顯著低于其他3組（P＜0.05）。試驗進行48h時，D組細胞內(nèi)MDA含量顯著高于其他3組（P＜0.05）。

表2 Marc-145細胞內(nèi)MDA含量檢測結(jié)果Table 2 The detection of MDA in Marc-145cells mmol／L

2.3 Marc-145細胞內(nèi)SOD活力的變化

結(jié)果見表3。由表3可知，試驗12h和24h時，D組和DLA組細胞內(nèi)SOD活力顯著低于NC組和LA組（P＜0.05）。在試驗36h時，LA組細胞內(nèi)SOD活力顯著高于其他3組（P＜0.05），D組細胞內(nèi)SOD活力顯著低于其他3組（P＜0.05）。試驗在48h時，D組細胞內(nèi)SOD活力顯著低于其他3組（P＜0.05），DLA組細胞內(nèi)SOD活力顯著高于D組（P＜0.05），同時顯著低于其他2組（P＜0.05）。

表3 Marc-145細胞內(nèi)SOD活力檢測結(jié)果Table 3 The detection of SOD in Marc-145cells mmol／L

2.4 Marc-145細胞內(nèi)CAT活力的變化

由表4可知，在試驗進行到24h時，D組細胞內(nèi)CAT活力顯著低于其他3組（P＜0.05），LA組細胞內(nèi)CAT活力顯著高于其他3組（P＜0.05）。試驗進行到36h和48h時，D組細胞內(nèi)CAT活力顯著低于其他3組（P＜0.05），LA組細胞內(nèi)CAT活力顯著高于其他3組（P＜0.05），DLA組細胞內(nèi)CAT活力顯著低于NC組和LA組（P＜0.05），同時顯著高于D組（P＜0.05）。

表4 Marc-145細胞內(nèi)CAT活力檢測結(jié)果Table 4 The detection of CAT in Marc-145cells mmol／L

3 討論

3.1 HP-PRRSV對 Marc-145細胞抗氧化功能的影響

研究表明，病毒可以通過改變宿主細胞的氧化平衡狀態(tài)，改變機體功能狀態(tài)。SOD和CAT是細胞內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，它們能有效清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，并能終止自由基連鎖反應(yīng)，保護細胞免受損傷。H2O2作為機體內(nèi)活性氧族的主要成分之一，其含量變化通?？梢苑从硻C體的氧化水平狀態(tài)［7］，MDA是脂質(zhì)過氧化降解的主要產(chǎn)物，反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的氧化程度及細胞受自由基攻擊的程度。本試驗采用HPPRRSV感染Marc-145細胞，結(jié)果表明，在試驗12h時，病毒組Marc-145細胞內(nèi)H2O2的含量顯著高于細胞對照組，SOD的活力顯著低于對照組，說明HP-PRRSV感染Marc-145細胞在造成ROS積累的同時，抑制細胞抗氧化酶的活性。在試驗24、36、48h時，病毒組細胞內(nèi)H2O2的含量和MDA含量顯著高于對照組，SOD和CAT活性顯著低于對照組，說明HP-PRRSV感染Marc-145細胞后，細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破，細胞內(nèi)抗氧化程度超出了氧化物的清除濃度，導(dǎo)致細胞氧化損傷。

3.2 α-硫辛酸對 HP-PRRSV接種 Marc-145細胞后細胞氧化功能的影響

LA是一種具有很強抗氧化活性的含硫抗氧化劑。研究表明，LA能夠清除出O2-、ROO·以外其他自由基和活性氧；同時LA也能夠再生還原細胞內(nèi)的一些抗氧化劑，如維生素E、維生素C和谷胱甘肽等，將這些抗氧化劑由氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型［8］。同時LA也可以作為氧化還原反應(yīng)鏈的阻斷劑參與抗氧化過程，如與自由基中間體反應(yīng)，使得活性基團無法從周圍脂質(zhì)中獲得H，從而阻斷氧化過程［9，11］。通過藥物毒性試驗，確定LA對Marc-145細胞的最大無毒劑量（TC0）為340μmol／L，所以本試驗在此范圍內(nèi)向Marc-145細胞加入LA，研究其對感染HP-PRRSV的Marc-145細胞抗氧化功能的影響。結(jié)果表明，在試驗24h時，DLA組細胞的CAT活性顯著高于D組；同時LA組細胞CAT活性顯著高于NC組，LA組細胞內(nèi)H2O2和MDA含量顯著少于NC組，說明LA能夠顯著抑制HP-PRRSV對Marc-145細胞CAT的活性的影響，同時能夠顯著提高Marc-145細胞CAT的活性，顯著減少H2O2和MDA的生成，同時。在試驗36h和48h時，DLA組細胞內(nèi)H2O2和MDA含量顯著低于D組，SOD和CAT活性顯著高于D組；LA組細胞內(nèi)CAT活性顯著高于NC組，說明LA能夠顯著抑制HP-PRRSV對Marc-145細胞CAT、SOD的活性和H2O2和MDA生成的影響；同時能夠提高 Marc-145細胞內(nèi)CAT活性。由此可以看出，活性氧自由基為LA對HP-PRRSV的抑制提供了依據(jù)，LA通過提高細胞的抗氧化能力，清除細胞內(nèi)ROS，減少病毒對細胞的氧化損傷。

綜上所述，HP-PRRSV能夠引起Marc-145細胞氧化損傷；在LA的作用下，Marc-145細胞抗氧化能力提升，ROS含量減少，脂質(zhì)過氧化減弱，能夠抑制HP-PRRSV對細胞的損傷。

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