豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白在豬小腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞周期的影響

常 嶸，張 琪，何亞鵬，童德文，許信剛

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一種2周齡以內(nèi)仔豬高度接觸性、致死率達(dá)可100%的腸道傳染病，臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水性腸炎［1］。在病毒性腹瀉流行與發(fā)生時(shí)，常存在以PEDV／RV／TGEV、PEDV／RV為主的混合感染［2］，且混合感染對(duì)機(jī)體的損傷比單一感染更為嚴(yán)重［3］。豬傳染性胃腸炎被列入OIE豬病名錄，是我國(guó)重點(diǎn)防控的疾病之一，其發(fā)生主要在春、秋兩季［4］。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，該病毒為有囊膜不分節(jié)斷的單股正鏈RNA病毒［5］。3′端有Poly（A）尾，5′端帽子與一個(gè)短序列相連；基因組長(zhǎng)約28.5kb，包括7個(gè)功能基因，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（纖突蛋白S、外膜蛋白sM、膜蛋白M和核衣殼蛋白N）和3種非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF1、ORF3和ORF7），按 基 因 組 排 序 為 5′-ORFla-ORFlb-SORF3a-ORF3b-sM-M-N-ORF7-3′［6］。TGEV N 基因全長(zhǎng)1 149bp，編碼382個(gè)氨基酸。N蛋白是一種磷酸化的酸性蛋白，與病毒基因組RNA緊密結(jié)合組成核蛋白核芯。N蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，同時(shí)在RNA的復(fù)制加工過(guò)程中起重要作用［7］。N蛋白通過(guò)活化p53信號(hào)通路參與TGEV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［8］。但是關(guān)于TGEV N 蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響目前研究較少，本研究旨在鑒定TGEV N蛋白在豬小腸上皮細(xì)胞 （swine intestinal epithelial cell，SIEC）中的表達(dá)并對(duì)細(xì)胞周期的影響，為下一步深入研究TGEV N蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 pEGFP-N1-N載體由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存［9］；豬小腸上皮細(xì)胞（SIEC）由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張彥明教授實(shí)驗(yàn)室建系并提供［10］。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖、RNase A 為Sigma公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、dNTP為Fermentas公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為大連 TaKaRa公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒為Vigorous公司產(chǎn)品；Trizol Regent試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、新生牛血清（NCS）為Gibco公司產(chǎn)品；DMEM／F-12為Thermo公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；鼠抗GFP單克隆抗體、PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為武漢博士德公司產(chǎn)品；RIPA裂解液為Solarbio公司產(chǎn)品；高靈敏型ECL發(fā)光劑為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；抗TGEV N蛋白多克隆抗體由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SIEC

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 豬小腸上皮細(xì)胞（SIEC）以DF12培養(yǎng)液，添加100mL／LFBS，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24h，胰酶消化SIEC并計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)細(xì)胞／孔密度接種6孔板，培養(yǎng)24h左右細(xì)胞達(dá)到70%～90%的匯合度，將質(zhì)粒pEGFP-N1、pEGFP-N1-N按Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL／L小牛血清的DF12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)用未加轉(zhuǎn)染液的細(xì)胞作對(duì)照。

1.2.2 蛋白表達(dá)的鑒定

1.2.2.1 RT-PCR鑒定 采用氯仿-異戊醇方法，從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取細(xì)胞的總RNA。RT體系：RNA模板 2μL，dNTPs 2μL，下游引物 2μL，DEPC水4μL，70℃作用5min。然后，向體系中加入5×RT buffer 5μL，RNase inhibitor 0.2μL，MMLV 0.5μL，DEPC水9.3μL。37℃孵育60min，95℃10min，4℃10min。PCR體系：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2，dNTPs各2μL，上、下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，cDNA 2μL，TaqDNA polymerase 0.2μL，滅菌雙蒸水15.3μL。PCR程序：95 ℃ 5min；94 ℃ 30s，56 ℃ 1min，72 ℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。引物序列和產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。引物由金斯瑞公司合成。

1.2.2.2 Western blot鑒定 收集瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，PBS洗3次，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12 000r／min離心10min，取上清，加入1／4體積的4×Loading buffer，煮沸10min。120g／L SDS-PAGE電泳分離膠和50g／L SDS-PAGE電泳濃縮膠上樣，電泳。將分離膠切下，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入含50g／L脫脂奶粉的PBS封閉液內(nèi)室溫封閉2h。封閉結(jié)束后，加入1∶500稀釋的鼠抗N蛋白單克隆抗體4℃過(guò)夜孵育，洗膜后以1∶10 000的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1.5h，洗去二抗后用ECL顯色，在暗室用X射線膠片顯影。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used for PCR

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化 收細(xì)胞樣品，胰酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化，1 000r／min離心3min，PBS液洗3次；然后750mL／L無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，4℃靜置5d～7d；預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，用1mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液重懸細(xì)胞，吹散，染色30min～120min，然后上機(jī)測(cè)樣。并用SIEC-pEGFP細(xì)胞株和正常SIEC作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SIEC

真核表達(dá)載體pEGFP-N1-N轉(zhuǎn)染到SIEC，轉(zhuǎn)染48h后于倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，融合蛋白EGFP-N在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，對(duì)照組EGFP在細(xì)胞中表達(dá) （圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒在SIEC中的表達(dá)Fig.1 pEGFP-N1-N expression in SIEC

2.2 N基因的RT-PCR鑒定

從細(xì)胞株中提取細(xì)胞總基因組的RNA，合成cDNA后，PCR鑒定目的基因。結(jié)果表明，擴(kuò)增出約1 149bp的N基因片段，與預(yù)期大小一致，說(shuō)明N基因已經(jīng)整合到細(xì)胞的基因組中（圖2）。

圖2 N基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 RT-PCR detection results of N gene

2.3 N蛋白 Western blot檢測(cè)

從細(xì)胞株中提取總蛋白進(jìn)行 Western blot檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)到了預(yù)期70ku的EGFP-N融合蛋白，因?yàn)镋GFP蛋白的分子質(zhì)量約為27ku，N蛋白的分子質(zhì)量約為43ku，結(jié)果與預(yù)期相符合（圖3）。

圖3 N蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western blot detection results of N protein

2.4 N蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響

利用流式細(xì)胞儀對(duì)N蛋白表達(dá)的SIEC細(xì)胞周期進(jìn)行分析見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，對(duì)照組SIEC的細(xì)胞周期 G0／G1期、S期和 G2／M 期的含量分別為82.55%、14.91%、2.54%；對(duì)照組細(xì)胞 SIEC-pEGFP-N1的細(xì)胞周期各期G0／G1期、S期和G2／M期的含量分別為84.01%、12.5%、3.5%；而試驗(yàn)組細(xì)胞pEGFP-N1-N的各細(xì)胞周期分別為G0／G1期70.02%、S期25.59%、G2／M 期4.39%。這表明TGEV N蛋白能夠延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S期。

3 討論

豬傳染性胃腸炎在多個(gè)國(guó)家及地區(qū)出現(xiàn)和流行，我國(guó)從20世紀(jì)50年代起就有豬傳染性胃腸炎的記載，近些年來(lái)其流行危害有進(jìn)一步加劇的趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［11］。TGEV屬于Ⅰ類冠狀病毒，主要經(jīng)口和鼻感染，小腸是該病毒的靶器官。SIEC作為TGEV天然的靶細(xì)胞，能夠更好地反映病毒對(duì)機(jī)體的致病作用。本試驗(yàn)選用SIEC表達(dá)TGEV N蛋白，為研究TGEV N蛋白的功能積累更多的理論資料。

研究表明，病毒感染宿主細(xì)胞后在特定的細(xì)胞周期進(jìn)行復(fù)制，并通過(guò)編碼特定的基因產(chǎn)物抑制細(xì)胞周期蛋白的活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯［12］。IBV、SARS等冠狀病毒的N蛋白通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白cyclin-CDK的活性影響S期細(xì)胞周期阻滯［13］。N蛋白作為TGEV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，還在病毒基因組RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄加工過(guò)程中具有重要作用。因此，本試驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)分析TGEV N蛋白對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組比較細(xì)胞周期S期含量呈上升趨勢(shì)且差異顯著，而細(xì)胞周期G0／G1和G2／M期變化差異不顯著，表明TGEV N蛋白的表達(dá)可以延長(zhǎng)細(xì)胞周期S期，抑制細(xì)胞通過(guò)S期進(jìn)入G2／M期進(jìn)而阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，說(shuō)明TGEV感染SIEC后調(diào)控細(xì)胞周期S期為自身生存創(chuàng)造有利條件。

圖4 流式細(xì)胞儀分析TGEV N蛋白的表達(dá)對(duì)SIEC細(xì)胞周期的影響Fig.4 Analysis of the stages of cell cycle with the cells expressing TGEV N protein by flow cytometry

總之，本試驗(yàn)成功地將重組質(zhì)粒在SIEC中獲得初步表達(dá)，熒光倒置顯微鏡可觀察到表達(dá)產(chǎn)物主要存在于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)N蛋白能夠延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S期，但N蛋白通過(guò)何種機(jī)制干擾宿主細(xì)胞周期尚不清楚。因此，試驗(yàn)擬將對(duì)TGEV N蛋白表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期蛋白活性的影響進(jìn)行深入研究，分析TGEV阻滯宿主細(xì)胞周期的機(jī)制。另外，從研究N蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響著手進(jìn)一步分析N蛋白的其他功能是下一步研究的重點(diǎn)。

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