豬膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損、軟骨下骨損傷后滑液中炎性因子水平變化

劉憲民，杜明昌，柳 椰，鄔 波，劉松波，王 琪，項(xiàng)良碧

1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院骨科全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心，遼寧沈陽(yáng)110016;2.沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110044

骨性關(guān)節(jié)炎是累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨及滑膜等組織結(jié)構(gòu)的慢性疾病，是生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及酶的反饋?zhàn)饔玫葟?fù)雜的多種機(jī)制相互作用的結(jié)果。軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞在骨性關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中，代謝平衡被打亂，代謝產(chǎn)物相互影響，具有能夠促進(jìn)軟骨降解、促進(jìn)滑膜炎癥或促進(jìn)軟骨合成等多種作用。炎癥因子水平一定程度上反映了骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化。本研究通過(guò)建立膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損、軟骨下骨外露動(dòng)物模型，應(yīng)用自體脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)移植修復(fù)軟骨缺損，觀察ADSCs移植后不同時(shí)間點(diǎn)軟骨缺損修復(fù)與關(guān)節(jié)滑液中反應(yīng)骨、軟骨代謝的相關(guān)炎性細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleakin-1β，IL-1β)和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)水平的變化[1-3]，以評(píng)估 ADSCs移植對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 低糖-培養(yǎng)基LG-DMEM(英杰生命科技有限公司);胎牛血清(FBS，GE Healthcare公司);L-谷氨酰胺(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);Ⅰ型膠原海綿(無(wú)錫貝迪生物有限公司);Ⅰ型膠原酶(美國(guó) Sigma公司)。IL-1β、TNF-α、MMP-13用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及豬原代ADSCs的獲取 選用6個(gè)月齡的巴馬小型豬12只，體質(zhì)量20～25 kg，雌雄不限(由黑龍江省雙鴨山市科技小型豬養(yǎng)殖場(chǎng)提供)。采用自體左、右后肢對(duì)照，造模后分別采用自體ADSCs移植治療(A組)及微骨折治療(B組)。全麻后氣管插管輔助通氣(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，取仰臥位，剃毛、消毒、鋪無(wú)菌單，采用真空負(fù)壓吸脂法吸取皮下脂肪約50 g。采用密度梯度離心法分離ADSCs，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液10 ml(含LG-DMEM，10%FBS，L-谷氨酰胺 300 μg/ml，抗壞血酸 50 μg/ml，青霉素、鏈霉素各 100 U/ml)，制成單細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)獲取細(xì)胞的數(shù)量(獲取的細(xì)胞用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn))。

1.3 細(xì)胞支架的制備 (1)用無(wú)菌剪刀將Ⅰ型膠原海綿剪成7 mm×7 mm×3 mm大小的方塊，分別放入24孔板中，備用;(2)向軟骨分化誘導(dǎo)因子的溶液制備:以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)為軟骨分化誘導(dǎo)因子，利用兩種因子的水溶性，配制濃度為20 ng/ml TGF-β2和400 ng/ml IGF-1的溶液;(3)將誘導(dǎo)液加入24孔板中，其中每孔加入誘導(dǎo)液1 ml，利用膠原海綿的吸水性，使膠原海綿支架與誘導(dǎo)液充分接觸均勻?；旌?0 min后，將24孔板放入-80℃冰箱進(jìn)行預(yù)凍8 h。最后將24孔板放入LGJ-冷凍干燥機(jī)。凍干后按照不同濃度將Ⅰ型膠原海綿和誘導(dǎo)因子復(fù)合支架密封包裝，進(jìn)行60Co照射后備用。

1.4 ADSCs支架復(fù)合體細(xì)胞的體外復(fù)合 取12孔培養(yǎng)板，取6孔，放入支架材料。將Ⅰ期獲取的細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/ml。滴加在海綿支架上，放入培養(yǎng)箱孵育2 h。

1.5 豬關(guān)節(jié)軟骨缺損的制備及修復(fù) 全麻狀態(tài)下，仰臥，取膝關(guān)節(jié)正中切口，由髕骨內(nèi)側(cè)進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，顯露關(guān)節(jié)軟骨，分別在內(nèi)、外髁用7 mm扁鑿制備邊長(zhǎng)為7 mm的正方形軟骨全層缺損，涉及軟骨下骨。將支架細(xì)胞復(fù)合物放入軟骨缺損部位。每組各3例，以吸收線縫合固定，分層關(guān)閉關(guān)節(jié)腔。術(shù)后不固定患肢，動(dòng)物圈中自由活動(dòng)，術(shù)后3 d給予肌注青霉素240 萬(wàn) U，肌注2次/d[4-5]。

1.6 術(shù)后取材與檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后2、4個(gè)月取材，大體觀察軟骨缺損區(qū)修復(fù)的形態(tài)，與正常組織界面等情況。收集關(guān)節(jié)內(nèi)滑液約0.3～0.5 ml，標(biāo)本送檢后，立即 4℃，14 000 r/min，離心20 min，留取上清液待測(cè)。ELISA檢測(cè) IL-1β、TNF-α、MMP-13 的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 軟骨缺損修復(fù)的大體觀察 術(shù)后2個(gè)月觀察:A組:關(guān)節(jié)面平整，白色膜狀物覆蓋缺損部位。缺損區(qū)由損傷邊緣開(kāi)始出現(xiàn)新生軟骨組織，色澤與周?chē)浌墙M織相近，質(zhì)實(shí)、有一定的彈性。B組:缺損部位明顯凹陷，邊緣有類(lèi)軟骨樣組織出現(xiàn)，整個(gè)缺損部位，顏色深紅，與周?chē)浌墙M織區(qū)別明顯。見(jiàn)圖1。

術(shù)后4個(gè)月觀察:A組:肉眼觀察缺損處關(guān)節(jié)面平整，可見(jiàn)模糊邊界。缺損區(qū)覆蓋新生軟骨組織，色澤與周?chē)浌墙M織相近，質(zhì)實(shí)、有一定的彈性。B組:肉眼觀察缺損處修復(fù)組織表面不整，呈不規(guī)則凹陷。缺損邊緣修復(fù)為類(lèi)軟骨組織，由邊緣向缺損中心逐步凹陷，缺損邊緣與周?chē)M織邊界仔細(xì)辨認(rèn)可區(qū)分，修復(fù)組織顏色由邊緣向中心逐漸變深。見(jiàn)圖2。

圖1 術(shù)后2個(gè)月軟骨缺損修復(fù)大體觀察

圖2 術(shù)后4個(gè)月軟骨缺損修復(fù)大體觀察

2.2 關(guān)節(jié)滑液中炎癥因子的變化 兩組關(guān)節(jié)滑液術(shù)后炎癥因子變化見(jiàn)表1。

表1 兩組術(shù)后炎癥因子變化(±s)

表1 兩組術(shù)后炎癥因子變化(±s)

注:A、B 組術(shù)后2、4 個(gè)月的 IL-1β、TNF-α、MMP-13 表達(dá)水平比較，P ＜0.05;A、B 組自身前后 IL-1β、TNF-α、MMP-13 表達(dá)水平比較，P ＜0.05。

組別 術(shù)后時(shí)間TNF-α(pg/ml)(月) n IL-1β(pg/ml)MMP-13(ng/ml)個(gè)月A 組 2 6 80.46 ±8.92 47.38 ±10.54 69.18 ±9.24 30.55 ±2個(gè)月 4個(gè)月2個(gè)月 4個(gè)月2個(gè)月 4 11.18 120.74 ±15.92 73.16 ±16.25 B 組 4 6 109.58 ±9.37 92.35 ±11.29 93.82 ±12.56 78.74 ±10.28 189.24 ±17.63 140.38 ±14.82

3 討論

目前研究認(rèn)為，骨性關(guān)節(jié)炎病因?qū)W主要有3個(gè)方面:一是關(guān)節(jié)軟骨破壞后軟骨細(xì)胞之間的代謝平衡喪失，二是炎性的滑膜組織釋放炎癥介質(zhì)，三是軟骨下骨骨細(xì)胞代謝平衡喪失。正常情況下，軟骨、軟骨下骨通過(guò)對(duì)合成代謝與分解代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。一旦退變或外傷等因素導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞代謝異常，則會(huì)引起滑膜的代謝異常。炎性因子的出現(xiàn)會(huì)進(jìn)一步引起軟骨的代謝，分解代謝的強(qiáng)度逐漸超過(guò)合成代謝，造成軟骨基質(zhì)的丟失，最初造成軟骨的粗糙不平以及細(xì)小的裂隙，最終致軟骨下骨顯露[6]。

研究表明，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與了骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，如轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰島素樣因子(insulin-like growth factor，IGF)、胰島素樣因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)、IL-1家族、TNF、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、黏附分子及整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrixmetallopreinase，TIMP)以及低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)。炎癥介質(zhì)大部分均為炎性的滑膜組織分泌，其中IL-l的浸潤(rùn)能夠增強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨MMP族中MMP-3、MMP-13的表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，刺激軟骨細(xì)胞和滑膜產(chǎn)生NO，抑制軟骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡[7]，加速軟骨細(xì)胞的退變，從而加劇退行性骨關(guān)節(jié)病，引起臨床上的一系列癥狀。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞產(chǎn)生，有抑制成骨細(xì)胞和刺激破骨細(xì)胞的作用，是人體內(nèi)作用最廣泛的致炎因子之一。TNF-α一方面可激活MMPs導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解，另一方面，還可作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，擴(kuò)大并加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨生存環(huán)境的改變，軟骨無(wú)法獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致退變[8]。

從治療上講，由于軟骨的自身能力有限，一般認(rèn)為直徑超過(guò)4 mm的軟骨缺損不能自行修復(fù)。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，多種治療手段已運(yùn)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，如關(guān)節(jié)內(nèi)清理和灌洗術(shù)、關(guān)節(jié)刨削成形術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)、微骨折、截骨術(shù)等傳統(tǒng)治療方法，但因修復(fù)組織以纖維軟骨為主，缺少正常透明軟骨的力學(xué)性能及耐用性，不可避免地會(huì)出現(xiàn)退行性變。所以，軟骨缺損修復(fù)的目標(biāo)是透明軟骨修復(fù)，與周?chē)M織的高度整合，提供長(zhǎng)期關(guān)節(jié)表面光整以及一致的機(jī)械負(fù)載性能。近年來(lái)，組織工程的迅速發(fā)展，特別是種子細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟，可降解生物材料的應(yīng)用，細(xì)胞生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)，為骨軟骨的修復(fù)提供了一個(gè)合乎生物學(xué)原則的思路[9-10]。

本研究利用ADSCs為種子細(xì)胞，復(fù)合在可緩釋誘導(dǎo)因子Ⅰ型膠原海綿支架上，移植修復(fù)軟骨缺損。通過(guò)大體觀察可發(fā)現(xiàn)，術(shù)后2個(gè)月ADSCs移植修復(fù)組(A組)已經(jīng)有類(lèi)軟骨組織形成，術(shù)后4個(gè)月的軟骨缺損部位完全修復(fù)，并形成透明軟骨組織。而且通過(guò)檢測(cè)關(guān)節(jié)滑液中炎性因子水平的變化，發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞移植修復(fù)組(A組)術(shù)后2、4個(gè)月后關(guān)節(jié)滑液中的 IL-1β、TNF-α、MMP-13表達(dá)水平均低于微骨折治療組(B組)，且術(shù)后4個(gè)月的表達(dá)水平低于術(shù)后2個(gè)月的表達(dá)水平。根據(jù)這一結(jié)果，可以推斷應(yīng)用自體ADSCs移植修復(fù)軟骨缺損，不但可以從結(jié)構(gòu)上重建軟骨組織，而且可以改善滑膜、軟骨、軟骨下骨等組織的異常代謝，從而減輕軟骨缺損導(dǎo)致的不適癥狀。

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