大菱鲆造血器官腫大病的病原分離、鑒定及藥物敏感性

鄧威等

摘 要：從患造血器官腫大病大菱鲆（Scophthalmus maximus）腎臟中分離到菌株NY79，對該菌株形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA等綜合分析，鑒定NY79為遲緩愛德華氏菌。NY79菌株對健康大菱鲆進行人工感染的試驗發(fā)現(xiàn)，感染發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致， 每條魚的LD50為2.4×104 cfu，表明遲緩愛德華氏菌為大菱鲆造血器官腫大病的病原。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，NY79對阿莫西林等17種藥物敏感，對紅霉素等4種藥物具耐受性。

關(guān)鍵詞：大菱鲆；遲緩愛德華氏菌；人工感染；藥物敏感性

中圖分類號：S965.3 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.011

Abstract：The dominant bacterial strain， designated as NY79，was isolated from kidney which was diseased hematopoietic organs swelling of Scophthalmus maximus. The biochemical and physiological characteristics of the isolated strain was studied by conventional method， such as 16SrRNA. The result confirmed that the stain NY79 was Eduardsiella tarda. The challenge tests were carried out by Scophthalmus maximus. with the pure culture of the isolated stain. The symptoms of the artificially infected fish were similar to those infected naturally. The LD50 of per fish was 2.4×104 cfu， it confirmed that Eduardsiella tarda was the pathogeny of the hematopoietic organs swelling of Scophthalmus maximus. Antibiotic sensitivity test showed that NY79 strain were sensitive to amoxicillin and other 17 kinds of antibiotics， and were resistant to erythromycin and other 4 kinds of antibiotics.

Key words： Scophthalmus maximus； Eduardsiella tarda； artificial infection； antimicrobial susceptibility

大菱鲆（scophthalmus maximus）為鰈形目（Pleuronectifoanes）鲆科（Bothidae）菱鲆屬（Scophthalmus）魚類，原產(chǎn)大西洋東北部區(qū)域，因生長迅速，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛。20世紀(jì)90年代被引進我國，如今已在我國北方沿海地區(qū)形成大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖[1-2]。伴隨著工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，大菱鲆的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度不斷增加，但養(yǎng)殖過程病害頻發(fā)，其主要原因是養(yǎng)殖水環(huán)境惡化以及藥物尤其是抗生素的濫用。細(xì)菌性疾病是大菱鲆養(yǎng)殖過程中的主要病害之一。其中遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）病最為常見，遲緩愛德華氏菌為兼性需氧革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），愛德華氏菌屬（Edwardsiella），該菌是一種重要的條件致病性人畜共患病原菌[3]。該菌的大規(guī)模爆發(fā)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，由此菌引起的魚類傳染病具有流行面積廣、發(fā)病率和死亡率都特別高的特點。該菌引發(fā)多種疾病，如魚類的敗血癥、腹水病等，它還能引起人類疾病，如腦膜炎、腹膜炎等[4]。

2013年秋季，筆者了解到天津濱海新區(qū)某養(yǎng)殖場的大菱鲆成魚發(fā)生死亡，死亡率較高。從病魚腎臟中分離出了一株優(yōu)勢菌，經(jīng)人工感染證實了該菌是引起此次病害的病原菌。對該菌生物學(xué)性狀和16SrRNA等進行研究，確定該菌為遲緩愛德華氏菌，并對該菌進行了藥物敏感性試驗，研究結(jié)果可為天津地區(qū)大菱鲆養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 致病菌的分離

患病大菱鲆采自天津某養(yǎng)殖場，主要癥狀為鰭條充血，解剖可見脾臟、腎臟等造血器官腫大，疾病暫命名為大菱鲆造血器官腫大病。

選取癥狀典型的病魚，通過無菌操作取病魚的肝、脾、腎組織小塊，分別劃線接種于2216E、 TSA瓊脂和SS培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24～48 h。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)，觀察選取優(yōu)勢菌株進行生化鑒定、分子生物學(xué)鑒定、回感試驗和藥敏試驗。

1.2 分離菌株理生化鑒定

革蘭氏染色：參照染色試劑盒說明書進行，主要步驟為涂片、干燥、固定、染色、鏡檢。

氧化酶試驗：挑取菌落少許，均勻涂抹在氧化酶試紙上，30 s內(nèi)觀察結(jié)果，紫色為陽性，無色或者黃色為陰性。

氧化發(fā)酵試驗：挑取單個菌落分別接種于2支氧化發(fā)酵生化管中，其中1支覆蓋滅菌液體石蠟，放入（28±1） ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。若生化管均變?yōu)辄S色為發(fā)酵型細(xì)菌。1支未變色，1支變?yōu)辄S色為氧化型細(xì)菌，2支均未變色為非發(fā)酵型細(xì)菌。

根據(jù)革蘭氏染色、氧化酶和氧化發(fā)酵試驗結(jié)果，采用ATB系統(tǒng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株進行生化鑒定，參照文獻[5-6]判斷分離菌株的種類。

1.3 分離菌株分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定主要采用16s rRNA方法進行，正向引物為27F：5-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3；反向引物1492R：5-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3。由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。50 μL的PCR反應(yīng)體系： 10×buffer緩沖液5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL， 10 mmol·L-1 dNTP 4 μL， 20 mmol·L-1 27F1 μL，20 mmol·L-11492R 1 μL，5 U·μL-1 Taq DNA聚合酶0.4 μL，2 μL模板。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，1次；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送金唯智生物科技（北京）有限公司測序。

測序結(jié)果通過NCBI中BLAST軟件進行在線比對，選取與其相似性最高的細(xì)菌16S rRNA基因序列，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析（Bootstraping）進行系統(tǒng)進化樹的評估，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.4 人工感染試驗

試驗用魚：大菱鲆全長（10±2） cm，水溫為（18±2） ℃，鹽度為（28±2）‰，暫養(yǎng)在試驗容器為150 L的水槽。

試驗分組：試驗設(shè)3個試驗組和1個對照組，每組10尾魚。先將分離的菌株接種在TSA瓊脂培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取數(shù)個單菌落至無菌生理鹽水中配置成菌懸液，調(diào)整其濃度分別為3×109，3×108，3×107 cfu·mL-1。每尾魚腹腔注射0.1 mL菌懸液，對照組則注射等量生理鹽水，觀察其感染后的發(fā)病與死亡情況，計算14 d內(nèi)的半數(shù)致死量。

對人工感染病魚癥狀進行觀察，與自然發(fā)病病魚癥狀進行比較；同時，采用與1.1、1.2、1.3相同方法，對人工感染病魚的病原進行分離鑒定。

1.5 藥敏試驗

藥敏試驗主要采用紙片擴散法（K-B法）進行。將細(xì)菌接種于MHA平板上于28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取數(shù)個單菌落制成1.5×108 cfu·mL-1的菌懸液，以滅菌棉拭子蘸取菌懸液分別均勻涂布于MHA平板，自然晾干15 min后，在無菌條件下，再用鑷子在酒精燈火焰上滅菌后略停，取藥敏紙片（購于杭州微生物試劑有限公司）分別貼于接種了細(xì)菌的MHA平板培養(yǎng)基表面，用鑷子輕按幾下使其貼牢，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)

分離菌株（編號NY79）在SS培養(yǎng)基中菌落呈中央黑周邊透明的露滴狀。鏡檢細(xì)菌為短桿狀，無莢，不形成芽袍，革蘭氏染色為革蘭氏陰性桿菌。氧化酶陰性，氧化發(fā)酵為發(fā)酵型細(xì)菌。經(jīng)ATB生化鑒定系統(tǒng) ID32GN試劑條鑒定，菌株NY79為遲緩愛德華氏菌，可信度為99.9%。

2.2 16SrRNA基因序列分析

為了進一步鑒定NY79菌株以及確定它的分類學(xué)地位，測定了其16S rRNA基因序列。PCR產(chǎn)物不包括引物結(jié)合區(qū)，筆者所獲得的16S rRNA基因序列有效長度為1 416 bp。將這條16S rRNA基因序列輸入國際互聯(lián)網(wǎng)GenBank中進行檢索，發(fā)現(xiàn)與該序列相似性最高的100個序列中4個為愛德華氏菌屬細(xì)菌的 16S rRNA基因序列，相似率均在99%以上，其余相似率都在97%以下。從這100 個序列中選取20個細(xì)菌的16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果如圖1所示。NY79 與Edwardsiella tarda EIB202聚成一個分支，序列相似率為99.86%，親緣關(guān)系最為接近。通過生理生化鑒定和16S rRNA基因序列的分析，NY79 鑒定為遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）。

2.3 人工感染試驗結(jié)果

人工感染試驗中，腹腔注射幾天后，各感染組陸續(xù)出現(xiàn)死亡，觀察死亡的大菱鲆其下頜、鰭基部以及腹面皮下充血發(fā)紅，眼內(nèi)有積水。解剖發(fā)現(xiàn)病魚鰓絲貧血，肝臟發(fā)白，脾臟腫大，腸粘膜充血，與自然狀態(tài)下患病的大菱鲆表現(xiàn)為臨床特征。同時，筆者對人工感染后的大菱鲆進行病原菌分離鑒定，鑒定結(jié)果亦為遲緩愛德華氏菌。此試驗說明愛德華氏菌為大菱鲆造血器官腫大病的病原。

根據(jù)改進的寇氏法[8]計算LD50，由表2可知，得到NY79的每條魚的LD50為2.4×104 cfu。

2.4 藥物敏感試驗結(jié)果

NY79對24種藥物的敏感性測定結(jié)果見表3，NY79對阿莫西林、多西環(huán)素、氯霉素、頭孢氨芐、氟苯尼考、頭孢呋辛、頭孢他啶、慶大霉素、頭孢吡肟、諾氟沙星、氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、左氟沙星、頭孢噻肟、呋喃唑酮、頭孢曲松17種藥物敏感；對阿莫西林/克拉維酸、萘啶酸、紅霉素、新諾明4種藥物耐受。

3 結(jié)論與討論

遲緩愛德華菌最早由Sakazaki和Murata在1959年從蛇（Serpentes）中分離得到。自1962年首次報道該菌感染魚類（鰻鱺Anguilla japonica）以來，該菌呈世界性分布，在非洲、美洲和亞洲已經(jīng)有較多報道，可以感染鰻鱺[9-10]、牙鲆（Paralichthys）、大菱鲆[11-12]等20多種食用魚類。在天津市遲緩愛德華菌引起的疾病已經(jīng)成為海水養(yǎng)殖魚類主要病害之一。薛淑霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌是大菱鲆和褐牙鲆腹水病的主要病原。筆者也報道了大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌，死亡率在30%左右，病魚主要癥狀為鰭條充血，解剖后可見脾臟、腎臟等器官腫大，但筆者未曾發(fā)現(xiàn)患病的大菱鲆腹腔有腹水，只是造血器官腫大，這應(yīng)當(dāng)引起重視。

目前天津地區(qū)大菱鲆的養(yǎng)殖主要以工廠化養(yǎng)殖為主，水產(chǎn)養(yǎng)殖中對大菱鲆細(xì)菌性疾病的防治主要還是依靠抗生素，然而抗生素容易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[14]，不能很好地預(yù)防和治療疾病，而且抗生素的濫用可能導(dǎo)致水環(huán)境污染等一系列問題。本研究中養(yǎng)殖場大菱鲆發(fā)病后，多種抗菌藥物治療沒有顯著效果，藥敏試驗發(fā)現(xiàn)分離的NY79菌株對24種藥物中的阿莫西林/克拉維酸、萘啶酸、紅霉素、新諾明不敏感，表現(xiàn)出一定的耐藥性。因此，根據(jù)本試驗藥敏結(jié)果應(yīng)選用高敏感的藥物用于疾病治療，也可選用兩種藥物協(xié)同使用，以提高藥物的使用效果，避免濫用藥物。在選擇藥物時應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，改進藥物投喂技術(shù)，選擇時針對性要強，減少藥物使用量及對環(huán)境的影響，這樣才能達到理想的治療效果。

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