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    巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病菌蛋白激酶基因突變體⊿CCK1的互補(bǔ)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    2015-06-15 21:06:25曹申文蒲金基張欣漆艷香韋運(yùn)謝
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期

    曹申文+蒲金基+張欣+漆艷香+韋運(yùn)謝+劉曉妹

    摘要:為了明確蛋白激酶CCK1在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能,在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)PCR擴(kuò)增,獲得了該基因1 604 bp的5′端片段(L-C5)和131 bp的3′端片段(L-C3),同時(shí)以pCAMBIA3300質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得了552 bp抗性標(biāo)記基因(L-Bar),并用In-Fusion HD Cloning Kit將L-Bar基因反向插入了L-C5和L-C3序列之間,克隆至pUC19載體上,成功構(gòu)建了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C。再?gòu)脑撦d體上擴(kuò)增互補(bǔ)片段,借助PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體的原生質(zhì)體,經(jīng)Basta平板篩選、PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定表明,獲得了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。為進(jìn)一步明確CCK1基因在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能打下了材料基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:多主棒孢菌;蛋白激酶基因CCK1;⊿CCK1突變體;互補(bǔ)載體;互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子

    中圖分類號(hào): S435 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)04-0027-03

    收稿日期:2014-10-15

    基金項(xiàng)目:中西部高校項(xiàng)目(編號(hào):ZXBJH-XK005);海南大學(xué)青年基金(編號(hào):qnjj1212);海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金(編號(hào):kyqd1427)。

    作者簡(jiǎn)介:曹申文(1990—),女,碩士研究生,主要從事植物病原真菌分子生物學(xué)研究。E-mail:hongshangcsw@qq.com。

    通信作者:劉曉妹,博士,副教授,主要從事熱帶作物病害病原菌致病基因研究。E-mail:lxmpll@126.com。

    由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola (Bert.&Curt.)Wei]引起的巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病是巴西橡膠樹(shù)的重要病害之一,現(xiàn)已在世界天然橡膠生產(chǎn)國(guó)普遍分布,該病害常造成橡膠樹(shù)周年反復(fù)落葉,植株生長(zhǎng)遲緩,枝條回枯或整株死亡,一般膠乳減產(chǎn)20%~45%[1-2]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)該病害的研究在病害診斷、病原菌生物學(xué)、病害流行學(xué)和防治技術(shù)等方面取得了較大進(jìn)展[3-7],但在分子生物學(xué)研究方面僅報(bào)道了4個(gè)致病相關(guān)基因CCK1[8]、CMP1[9]、CCHog1[10]、cas[11],且大多處于序列特征分析階段。其中,CCK1是本實(shí)驗(yàn)室從巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中克隆獲得的一個(gè)PMK1類促分裂原活化蛋白激酶基因[12],經(jīng)前期鑒定,初步確定CCK1基因可能在多主棒孢菌的菌落和菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢、對(duì)環(huán)境的識(shí)別、毒素的產(chǎn)生以及致病性等方面起重要作用,并參與調(diào)控高滲脅迫反應(yīng)[8]。但這些功能仍需通過(guò)互補(bǔ)突變體試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確,而通過(guò)構(gòu)建其互補(bǔ)載體和轉(zhuǎn)化突變菌株獲得互補(bǔ)菌株是關(guān)鍵步驟。本研究以Bar基因?yàn)榭剐赃x擇標(biāo)記,用In-Fusion HD Cloning Kit成功構(gòu)建了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCKB,并轉(zhuǎn)化了⊿CCK1突變株的原生質(zhì)體,獲得 ⊿CCK1 互補(bǔ)菌株,為明確CCK1基因的功能、揭示巴西橡膠樹(shù)棒孢霉病菌致病機(jī)制打下了材料基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試菌株和質(zhì)粒:巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病菌CC004菌株和含Bar基因的質(zhì)粒pCAMBIA3300,均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。CCK1基因突變體 ⊿CCK1 由筆者所在課題組提供。

    供試試劑:Fungal gDNA Kit 和Mini Plasmid Kit 為BioMiga 公司產(chǎn)品;In-Fusion HD Cloning Kit為Clontech 公司產(chǎn)品;Peasy-T1和大腸感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α為TransGen Biotech公司產(chǎn)品;2×(HS)Taq-Mixture Kit 和TIANgel Midi Purification Kit為TIANGEN公司產(chǎn)品;核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自廣東省廣州東盛生物科技有限公司;GoldView DNA染料購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所;Ampicillin和Basta為Amresco進(jìn)口分裝;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;引物合成和測(cè)序均由華大基因生物科技有限公司(深圳)完成。 供試引物見(jiàn)表1。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA的提取 接種巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌CC004菌餅于PD培養(yǎng)液中,28 ℃、150 r/min、黑暗搖床培養(yǎng)4~5 d,收集菌絲,用Fungal gDNA Kit提取基因組DNA。 1.2.2 ⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體構(gòu)建 先以野生菌株CC004的gDNA和質(zhì)粒pCAMBIA3300為模板,分別擴(kuò)增CCK1基因5′端片段C5(包含CCK1基因編碼區(qū)上游序列和CCK1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列)、3′端片段C3(CCK1基因終止密碼子后的一段序列)及完整的Bar基因,分別克隆于Peasy-T1載體上,選擇陽(yáng)性克隆測(cè)序,再以序列完全正確的陽(yáng)性克隆為模板,分別擴(kuò)增含同源重組序列的CCK1基因5′端、3′端和Bar片段L-C5、L-C3、L-Bar。純化擴(kuò)增產(chǎn)物,再用In-Fusion HD Cloning Kit 將L-Bar基因反向連接于 L-C5 和L-C3之間,連接至pUC19載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α,用pUC19載體通用引物檢測(cè)克隆,挑陽(yáng)性克隆測(cè)序,篩選插入片段序列沒(méi)有堿基錯(cuò)配的克隆提取質(zhì)粒,即完成CCK1基

    表1 所用引物信息

    序號(hào) 擴(kuò)增片段 引物序列

    1 C5:CCK1基因上游 F:5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R:5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

    2 C3:CCK1基因下游 F:5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R:5′-CGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

    3 Bar:除草劑Bar基因 F:5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′;R:5′-TCTCAAATCTCGGTGACG-3′

    4 L-C5:CCK1基因上游重疊片段 F:5′-CGGTACCCGGGGATCCCCGTTCATTGTCCCA-3′;R:5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

    5 L-C3:CCK1基因下游重疊片段 F:5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R:5′-CGACTCTAGAGGATCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

    6

    L-Bar:除草劑Bar基因重疊片段

    F:5′-TCGGCTGTATGACTCTCAAATCTCGGTGACG-3′;R:5′-CTCAGACATGGCACCATGAGCCCAGAACGACGC-3′

    7 pUC19載體通用引物 F:5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;R:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

    8 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)片段 F:5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R:5′-GGTAACAGGCAGGATTAGAT-3′

    9 FBB:檢測(cè)轉(zhuǎn)化子特異性引物 F:5′-TGGTGGAACAATGGCTAATGG-3′;R:5′-GCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

    注:邊框部分序列為L(zhǎng)-C5或L-C3與pUC19載體重疊序列;劃單線部分序列為L(zhǎng)-Bar與片段L-C5或L-C3重疊序列。

    因互補(bǔ)載體的構(gòu)建(圖1)。

    (1)目的片段擴(kuò)增。構(gòu)建CCK1基因互補(bǔ)載體所需引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系(50 μL):gDNA或質(zhì)粒pCAMBIA3300 2 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L) 5 μL、上或下游引物 (10 μmol/L)各2 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase (2.5 U/μL) 1 μL、ddH2O 28 μL。C5/L-C5擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 2 min,循環(huán)35周;72 ℃ 10 min,預(yù)期大小約為 1 600 bp。C3/L-C3擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,51 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35周;72 ℃ 5 min,預(yù)期大小約 100 bp。Bar/L-Bar擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35周;72 ℃ 5 min,預(yù)期大小約550 bp。

    (2)互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C的生成。連接體系20 μL:pUC19 Control Vector Linearized (50 ng/μL) 2.0 μL、Purified products(100~200 ng/μL)2.0 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix(5 U/μL)6.0 μL、ddH2O 6.0 μL。上述混合液50 ℃ 孵育15 min后,進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。并用pUC19載體通用引物檢測(cè)克隆,預(yù)期片段大小約為2 400 bp。送陽(yáng)性克隆測(cè)序,將序列完全正確重組質(zhì)粒命名為p⊿CCK1-C,即獲得了⊿CCK1突變體互補(bǔ)載體。

    1.2.3 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的獲得和PCR驗(yàn)證

    1.2.3.1 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)片段的擴(kuò)增 以L-C5::Bar::L-C3基因序列設(shè)計(jì)引物CCKB-F/R,以p⊿CCK1-C為模板,擴(kuò)增一段含完整CCK1基因、Bar基因和CCK1基因終止密碼子后一段序列的片段。擴(kuò)增體系同上。擴(kuò)增條件:95 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 2 min 30 s,循環(huán)35周;72 ℃ 10 min。該片段預(yù)期大小2 196 bp。用TIANgel Midi Purification Kit回收該片段??寺y(cè)序正確后,再純化用作互補(bǔ)片段。

    1.2.3.2 互補(bǔ)片段的轉(zhuǎn)化 參照劉曉妹的方法[1],將回收的片段在PEG介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體原生質(zhì)體,用含 4 mg/mL Basta(對(duì)CC004和⊿CCK1菌株的最低抑菌濃度)的PDS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng),培養(yǎng)條件為28 ℃黑暗。待有菌落長(zhǎng)出后,用無(wú)菌牙簽蘸取邊緣菌絲,接于含4 mg/mL Basta的PDA平板上進(jìn)行連續(xù)5次純化。

    1.2.3.3 互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證 用Fungal gDNA Kit提取野生型菌株CC004、⊿CCK1突變體和純化后的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子基因組DNA。用特異性引物FBB-F/R進(jìn)行PCR鑒定,預(yù)期在野生型菌株CC004中擴(kuò)增到的條帶大小約1 100 bp,在⊿CCK1突變體中擴(kuò)增不到條帶,在互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中能擴(kuò)增到約 1 600 bp 條帶的即為⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。將符合預(yù)期的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子條帶回收并克隆到Peasy-T1上并測(cè)序,進(jìn)一步驗(yàn)證序列的正確性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌CC004基因組DNA的提取

    從圖2可以看出,在15 000 bp以上位置有清晰條帶??梢?jiàn)所提取的CC004菌株的DNA比較完整,適合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

    2.2 ⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體構(gòu)建

    2.2.1 目的片段擴(kuò)增 C5、C3、Bar擴(kuò)增條帶分別在約 1 600、550、100 bp處,符合預(yù)期大?。▓D3)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序后,選擇序列完全正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

    2.2.2 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C的生成 以獲得序列正確的陽(yáng)性克隆為模板,用高保真酶擴(kuò)增回收L-C5、L-C3、L-Bar片段,用In-Fusion HD Cloning Kit 將其連接至pUC19載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選了12個(gè)克隆,用載體通用引物M13-F/R檢測(cè),結(jié)果表明,在12個(gè)克隆中均擴(kuò)增到了約2 400 bp的片段(圖4),符合預(yù)期大小。測(cè)序結(jié)果表明,有3個(gè)陽(yáng)性克隆的序列完全正確,說(shuō)明 ⊿CCK1 突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C構(gòu)建成功。

    2.3 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的獲得和PCR驗(yàn)證

    以互補(bǔ)載體質(zhì)粒p⊿CCK-C為模板,用引物組合CCKB-F/R擴(kuò)增獲得了一段大小約2 200 bp的互補(bǔ)片段(圖5)。用該片段轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體原生質(zhì)體,經(jīng)過(guò)含Basta的平板篩選和純化后,提取基因組,用特異性引物FBB-F/R擴(kuò)增驗(yàn)證。結(jié)果表明,在野生型CC004基因組中擴(kuò)增到大小為

    1 100 bp的條帶,在⊿CCK1突變體中未擴(kuò)增到條帶,在9個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增到大小約為1 600 bp的條帶,送樣測(cè)序,其中3號(hào)樣與預(yù)期完全相符(圖6)。說(shuō)明⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子獲得成功。

    3 結(jié)論與討論

    基因敲入是通過(guò)同源重組的方法,將基因編碼序列用另一基因編碼序列進(jìn)行替換的技術(shù)。通過(guò)基因敲入,可以讓基因在體內(nèi)表達(dá)、研究其功能;也可以將正?;蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到驗(yàn)證其基因功能的目的[13]。本研究構(gòu)建的p⊿CCK1-C基因互補(bǔ)載體屬于置換型載體。已有文獻(xiàn)報(bào)道,在構(gòu)建基因敲除置換型載體時(shí),目的基因兩端的同源序列越大,發(fā)生同源重組的概率越高。對(duì)于絲狀真菌而言,同源序列最好在500 bp以上[14]。且由于線性化質(zhì)粒相對(duì)于環(huán)形質(zhì)粒而言有可能更有利于提高轉(zhuǎn)化率,本試驗(yàn)以互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C為模板擴(kuò)增長(zhǎng)片段序列進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)構(gòu)建的p⊿CCK1-C載體,同源片段為887 bp,置換片段與⊿CCK1突變體也仍有814 bp同源序列,符合置換載體的構(gòu)建要求。將置換片段PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體,成功獲得⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。

    傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法需要載體外對(duì)DNA 片段進(jìn)行繁瑣的酶切、連接、亞克隆和鑒定等步驟,費(fèi)力費(fèi)時(shí)[15]。本試驗(yàn)采用了Clontech公司的In-fusion克隆技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)相連片段附加15 bp同源堿基令不同片段進(jìn)行平末端連接,不附加多余序列,也不受限制性酶切位點(diǎn)的限制,簡(jiǎn)便、高效。

    前期筆者所在課題組已成功獲得CCK1基因敲除突變體⊿CCK1,表型測(cè)定表明,⊿CCK1完全失去產(chǎn)孢能力菌餅接種時(shí),⊿CCK1突變體致病力喪失,且在菌落和菌絲形態(tài)、對(duì)環(huán)境的識(shí)別、毒素的產(chǎn)生等方面也與野生型存在明顯的差異[8]。本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子表型,為進(jìn)一步明確CCK1在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能打下了良好的材料基礎(chǔ)。

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