• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病菌蛋白激酶基因突變體⊿CCK1的互補(bǔ)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    2015-06-15 21:06:25曹申文蒲金基張欣漆艷香韋運(yùn)謝
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期

    曹申文+蒲金基+張欣+漆艷香+韋運(yùn)謝+劉曉妹

    摘要:為了明確蛋白激酶CCK1在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能,在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)PCR擴(kuò)增,獲得了該基因1 604 bp的5′端片段(L-C5)和131 bp的3′端片段(L-C3),同時(shí)以pCAMBIA3300質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得了552 bp抗性標(biāo)記基因(L-Bar),并用In-Fusion HD Cloning Kit將L-Bar基因反向插入了L-C5和L-C3序列之間,克隆至pUC19載體上,成功構(gòu)建了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C。再?gòu)脑撦d體上擴(kuò)增互補(bǔ)片段,借助PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體的原生質(zhì)體,經(jīng)Basta平板篩選、PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定表明,獲得了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。為進(jìn)一步明確CCK1基因在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能打下了材料基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:多主棒孢菌;蛋白激酶基因CCK1;⊿CCK1突變體;互補(bǔ)載體;互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子

    中圖分類號(hào): S435 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)04-0027-03

    收稿日期:2014-10-15

    基金項(xiàng)目:中西部高校項(xiàng)目(編號(hào):ZXBJH-XK005);海南大學(xué)青年基金(編號(hào):qnjj1212);海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金(編號(hào):kyqd1427)。

    作者簡(jiǎn)介:曹申文(1990—),女,碩士研究生,主要從事植物病原真菌分子生物學(xué)研究。E-mail:hongshangcsw@qq.com。

    通信作者:劉曉妹,博士,副教授,主要從事熱帶作物病害病原菌致病基因研究。E-mail:lxmpll@126.com。

    由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola (Bert.&Curt.)Wei]引起的巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病是巴西橡膠樹(shù)的重要病害之一,現(xiàn)已在世界天然橡膠生產(chǎn)國(guó)普遍分布,該病害常造成橡膠樹(shù)周年反復(fù)落葉,植株生長(zhǎng)遲緩,枝條回枯或整株死亡,一般膠乳減產(chǎn)20%~45%[1-2]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)該病害的研究在病害診斷、病原菌生物學(xué)、病害流行學(xué)和防治技術(shù)等方面取得了較大進(jìn)展[3-7],但在分子生物學(xué)研究方面僅報(bào)道了4個(gè)致病相關(guān)基因CCK1[8]、CMP1[9]、CCHog1[10]、cas[11],且大多處于序列特征分析階段。其中,CCK1是本實(shí)驗(yàn)室從巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中克隆獲得的一個(gè)PMK1類促分裂原活化蛋白激酶基因[12],經(jīng)前期鑒定,初步確定CCK1基因可能在多主棒孢菌的菌落和菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢、對(duì)環(huán)境的識(shí)別、毒素的產(chǎn)生以及致病性等方面起重要作用,并參與調(diào)控高滲脅迫反應(yīng)[8]。但這些功能仍需通過(guò)互補(bǔ)突變體試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確,而通過(guò)構(gòu)建其互補(bǔ)載體和轉(zhuǎn)化突變菌株獲得互補(bǔ)菌株是關(guān)鍵步驟。本研究以Bar基因?yàn)榭剐赃x擇標(biāo)記,用In-Fusion HD Cloning Kit成功構(gòu)建了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCKB,并轉(zhuǎn)化了⊿CCK1突變株的原生質(zhì)體,獲得 ⊿CCK1 互補(bǔ)菌株,為明確CCK1基因的功能、揭示巴西橡膠樹(shù)棒孢霉病菌致病機(jī)制打下了材料基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試菌株和質(zhì)粒:巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病菌CC004菌株和含Bar基因的質(zhì)粒pCAMBIA3300,均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。CCK1基因突變體 ⊿CCK1 由筆者所在課題組提供。

    供試試劑:Fungal gDNA Kit 和Mini Plasmid Kit 為BioMiga 公司產(chǎn)品;In-Fusion HD Cloning Kit為Clontech 公司產(chǎn)品;Peasy-T1和大腸感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α為TransGen Biotech公司產(chǎn)品;2×(HS)Taq-Mixture Kit 和TIANgel Midi Purification Kit為TIANGEN公司產(chǎn)品;核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自廣東省廣州東盛生物科技有限公司;GoldView DNA染料購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所;Ampicillin和Basta為Amresco進(jìn)口分裝;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;引物合成和測(cè)序均由華大基因生物科技有限公司(深圳)完成。 供試引物見(jiàn)表1。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA的提取 接種巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌CC004菌餅于PD培養(yǎng)液中,28 ℃、150 r/min、黑暗搖床培養(yǎng)4~5 d,收集菌絲,用Fungal gDNA Kit提取基因組DNA。 1.2.2 ⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體構(gòu)建 先以野生菌株CC004的gDNA和質(zhì)粒pCAMBIA3300為模板,分別擴(kuò)增CCK1基因5′端片段C5(包含CCK1基因編碼區(qū)上游序列和CCK1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列)、3′端片段C3(CCK1基因終止密碼子后的一段序列)及完整的Bar基因,分別克隆于Peasy-T1載體上,選擇陽(yáng)性克隆測(cè)序,再以序列完全正確的陽(yáng)性克隆為模板,分別擴(kuò)增含同源重組序列的CCK1基因5′端、3′端和Bar片段L-C5、L-C3、L-Bar。純化擴(kuò)增產(chǎn)物,再用In-Fusion HD Cloning Kit 將L-Bar基因反向連接于 L-C5 和L-C3之間,連接至pUC19載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α,用pUC19載體通用引物檢測(cè)克隆,挑陽(yáng)性克隆測(cè)序,篩選插入片段序列沒(méi)有堿基錯(cuò)配的克隆提取質(zhì)粒,即完成CCK1基

    表1 所用引物信息

    序號(hào) 擴(kuò)增片段 引物序列

    1 C5:CCK1基因上游 F:5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R:5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

    2 C3:CCK1基因下游 F:5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R:5′-CGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

    3 Bar:除草劑Bar基因 F:5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′;R:5′-TCTCAAATCTCGGTGACG-3′

    4 L-C5:CCK1基因上游重疊片段 F:5′-CGGTACCCGGGGATCCCCGTTCATTGTCCCA-3′;R:5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

    5 L-C3:CCK1基因下游重疊片段 F:5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R:5′-CGACTCTAGAGGATCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

    6

    L-Bar:除草劑Bar基因重疊片段

    F:5′-TCGGCTGTATGACTCTCAAATCTCGGTGACG-3′;R:5′-CTCAGACATGGCACCATGAGCCCAGAACGACGC-3′

    7 pUC19載體通用引物 F:5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;R:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

    8 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)片段 F:5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R:5′-GGTAACAGGCAGGATTAGAT-3′

    9 FBB:檢測(cè)轉(zhuǎn)化子特異性引物 F:5′-TGGTGGAACAATGGCTAATGG-3′;R:5′-GCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

    注:邊框部分序列為L(zhǎng)-C5或L-C3與pUC19載體重疊序列;劃單線部分序列為L(zhǎng)-Bar與片段L-C5或L-C3重疊序列。

    因互補(bǔ)載體的構(gòu)建(圖1)。

    (1)目的片段擴(kuò)增。構(gòu)建CCK1基因互補(bǔ)載體所需引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系(50 μL):gDNA或質(zhì)粒pCAMBIA3300 2 μL、dNTPs(各2.5 mmol/L) 5 μL、上或下游引物 (10 μmol/L)各2 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase (2.5 U/μL) 1 μL、ddH2O 28 μL。C5/L-C5擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 2 min,循環(huán)35周;72 ℃ 10 min,預(yù)期大小約為 1 600 bp。C3/L-C3擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,51 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35周;72 ℃ 5 min,預(yù)期大小約 100 bp。Bar/L-Bar擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35周;72 ℃ 5 min,預(yù)期大小約550 bp。

    (2)互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C的生成。連接體系20 μL:pUC19 Control Vector Linearized (50 ng/μL) 2.0 μL、Purified products(100~200 ng/μL)2.0 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix(5 U/μL)6.0 μL、ddH2O 6.0 μL。上述混合液50 ℃ 孵育15 min后,進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。并用pUC19載體通用引物檢測(cè)克隆,預(yù)期片段大小約為2 400 bp。送陽(yáng)性克隆測(cè)序,將序列完全正確重組質(zhì)粒命名為p⊿CCK1-C,即獲得了⊿CCK1突變體互補(bǔ)載體。

    1.2.3 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的獲得和PCR驗(yàn)證

    1.2.3.1 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)片段的擴(kuò)增 以L-C5::Bar::L-C3基因序列設(shè)計(jì)引物CCKB-F/R,以p⊿CCK1-C為模板,擴(kuò)增一段含完整CCK1基因、Bar基因和CCK1基因終止密碼子后一段序列的片段。擴(kuò)增體系同上。擴(kuò)增條件:95 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 2 min 30 s,循環(huán)35周;72 ℃ 10 min。該片段預(yù)期大小2 196 bp。用TIANgel Midi Purification Kit回收該片段??寺y(cè)序正確后,再純化用作互補(bǔ)片段。

    1.2.3.2 互補(bǔ)片段的轉(zhuǎn)化 參照劉曉妹的方法[1],將回收的片段在PEG介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體原生質(zhì)體,用含 4 mg/mL Basta(對(duì)CC004和⊿CCK1菌株的最低抑菌濃度)的PDS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng),培養(yǎng)條件為28 ℃黑暗。待有菌落長(zhǎng)出后,用無(wú)菌牙簽蘸取邊緣菌絲,接于含4 mg/mL Basta的PDA平板上進(jìn)行連續(xù)5次純化。

    1.2.3.3 互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證 用Fungal gDNA Kit提取野生型菌株CC004、⊿CCK1突變體和純化后的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子基因組DNA。用特異性引物FBB-F/R進(jìn)行PCR鑒定,預(yù)期在野生型菌株CC004中擴(kuò)增到的條帶大小約1 100 bp,在⊿CCK1突變體中擴(kuò)增不到條帶,在互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中能擴(kuò)增到約 1 600 bp 條帶的即為⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。將符合預(yù)期的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子條帶回收并克隆到Peasy-T1上并測(cè)序,進(jìn)一步驗(yàn)證序列的正確性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌CC004基因組DNA的提取

    從圖2可以看出,在15 000 bp以上位置有清晰條帶??梢?jiàn)所提取的CC004菌株的DNA比較完整,適合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

    2.2 ⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體構(gòu)建

    2.2.1 目的片段擴(kuò)增 C5、C3、Bar擴(kuò)增條帶分別在約 1 600、550、100 bp處,符合預(yù)期大?。▓D3)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序后,選擇序列完全正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

    2.2.2 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C的生成 以獲得序列正確的陽(yáng)性克隆為模板,用高保真酶擴(kuò)增回收L-C5、L-C3、L-Bar片段,用In-Fusion HD Cloning Kit 將其連接至pUC19載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選了12個(gè)克隆,用載體通用引物M13-F/R檢測(cè),結(jié)果表明,在12個(gè)克隆中均擴(kuò)增到了約2 400 bp的片段(圖4),符合預(yù)期大小。測(cè)序結(jié)果表明,有3個(gè)陽(yáng)性克隆的序列完全正確,說(shuō)明 ⊿CCK1 突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C構(gòu)建成功。

    2.3 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的獲得和PCR驗(yàn)證

    以互補(bǔ)載體質(zhì)粒p⊿CCK-C為模板,用引物組合CCKB-F/R擴(kuò)增獲得了一段大小約2 200 bp的互補(bǔ)片段(圖5)。用該片段轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體原生質(zhì)體,經(jīng)過(guò)含Basta的平板篩選和純化后,提取基因組,用特異性引物FBB-F/R擴(kuò)增驗(yàn)證。結(jié)果表明,在野生型CC004基因組中擴(kuò)增到大小為

    1 100 bp的條帶,在⊿CCK1突變體中未擴(kuò)增到條帶,在9個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增到大小約為1 600 bp的條帶,送樣測(cè)序,其中3號(hào)樣與預(yù)期完全相符(圖6)。說(shuō)明⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子獲得成功。

    3 結(jié)論與討論

    基因敲入是通過(guò)同源重組的方法,將基因編碼序列用另一基因編碼序列進(jìn)行替換的技術(shù)。通過(guò)基因敲入,可以讓基因在體內(nèi)表達(dá)、研究其功能;也可以將正?;蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到驗(yàn)證其基因功能的目的[13]。本研究構(gòu)建的p⊿CCK1-C基因互補(bǔ)載體屬于置換型載體。已有文獻(xiàn)報(bào)道,在構(gòu)建基因敲除置換型載體時(shí),目的基因兩端的同源序列越大,發(fā)生同源重組的概率越高。對(duì)于絲狀真菌而言,同源序列最好在500 bp以上[14]。且由于線性化質(zhì)粒相對(duì)于環(huán)形質(zhì)粒而言有可能更有利于提高轉(zhuǎn)化率,本試驗(yàn)以互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C為模板擴(kuò)增長(zhǎng)片段序列進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)構(gòu)建的p⊿CCK1-C載體,同源片段為887 bp,置換片段與⊿CCK1突變體也仍有814 bp同源序列,符合置換載體的構(gòu)建要求。將置換片段PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體,成功獲得⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。

    傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法需要載體外對(duì)DNA 片段進(jìn)行繁瑣的酶切、連接、亞克隆和鑒定等步驟,費(fèi)力費(fèi)時(shí)[15]。本試驗(yàn)采用了Clontech公司的In-fusion克隆技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)相連片段附加15 bp同源堿基令不同片段進(jìn)行平末端連接,不附加多余序列,也不受限制性酶切位點(diǎn)的限制,簡(jiǎn)便、高效。

    前期筆者所在課題組已成功獲得CCK1基因敲除突變體⊿CCK1,表型測(cè)定表明,⊿CCK1完全失去產(chǎn)孢能力菌餅接種時(shí),⊿CCK1突變體致病力喪失,且在菌落和菌絲形態(tài)、對(duì)環(huán)境的識(shí)別、毒素的產(chǎn)生等方面也與野生型存在明顯的差異[8]。本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子表型,為進(jìn)一步明確CCK1在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能打下了良好的材料基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Pu J J,Zhang X,Qi Y X,et al. First record of Corynespora leaf fall disease of hevea rubber tree in China[J]. Australasian Plant Disease Notes,2007,2(1):35-36.

    [2]張 欣,蒲金基,謝藝賢,等. 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病發(fā)生情況調(diào)查[J]. 植物檢疫,2007,21(6):372-373.

    [3]張 賀,蒲金基,張 欣,等. 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病原菌的生物學(xué)特性[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào),2007,28(3):83-87.

    [4]Qi Y X,Pu J J,Zhang H Q,et al. Detection of Corynespora cassicola in hevea rubber tree from China[J]. Australasian Plant Disease Notes,2007,2(1):153-155.

    [5]Qi Y X,Zhang X,Pu J J,et al. Morphological and molecular analysis of genetic variability within isolates of Corynespora cassiicola from different hosts[J]. Eur J Plant Pathol,2011,130(1):83-95.

    [6]張 賀,張 欣,蒲金基,等. 巴西橡膠樹(shù)品系對(duì)棒孢霉落葉病的抗病性鑒定[J]. 植物保護(hù),2008,34(4):54-56.

    [7]陳 照,蒲金基,張 欣,等. 殺菌劑對(duì)巴西橡膠棒孢霉落葉病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥,2007,6(2):41-43.

    [8]劉曉妹. 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病菌MAPK基因(CCK1)和毒素基因(ct)克隆與功能鑒定[D]. ??冢汉D洗髮W(xué),2012.

    [9]漆艷香. 中國(guó)巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病原學(xué)研究[D].南寧: 廣西大學(xué),2010.

    [10]王延麗,林春花,時(shí) 濤,等. 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌Hogl同源基因的克隆和序列分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào),2013,34(3):424-428.

    [11]Barthe P,Pujade-Renaud V,Breton F,et al. Structural analysis of cassiicolin,a host-selective protein toxin from Corynespora cassiicola[J]. Journal of Molecular Biology,2007,367(1):89-101.

    [12]劉曉妹,蒲金基,張 欣,等. 多主棒孢菌調(diào)控致病性相關(guān)基因CCK1的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2012,(10):168-172.

    [13]杜玉梅,左正宏. 基因功能研究方法的新進(jìn)展[J]. 生命科學(xué),2008,20(4):589-592.

    [14]Yu J H,Hamari Z,Han K H.A PCR-based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi[J]. Fungal Genetics and Biology,2004,41:973-981.

    [15]許 楊,涂 追. 絲狀真菌基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,26(1):120-126.

    少妇人妻精品综合一区二区 | 色综合色国产| 身体一侧抽搐| 国产一区二区三区av在线 | 日韩成人伦理影院| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 深爱激情五月婷婷| 国产精华一区二区三区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 在线播放无遮挡| 日本-黄色视频高清免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 日韩国内少妇激情av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久久久大av| 欧美在线一区亚洲| 性欧美人与动物交配| 99久久精品一区二区三区| 国产精品一区二区性色av| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久久久九九精品影院| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产亚洲91精品色在线| videossex国产| 国产精华一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产免费男女视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 99在线人妻在线中文字幕| 能在线免费看毛片的网站| 午夜福利成人在线免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 我要看日韩黄色一级片| 久久精品夜色国产| 久久久精品大字幕| 在线观看66精品国产| 欧美bdsm另类| 国产黄色小视频在线观看| 国产美女午夜福利| 欧美一级a爱片免费观看看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久亚洲精品不卡| 欧美zozozo另类| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久久久久成人| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人av在线播放网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99在线视频只有这里精品首页| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲经典国产精华液单| 欧美bdsm另类| 岛国在线免费视频观看| 韩国av在线不卡| 天堂影院成人在线观看| 国产在线男女| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲经典国产精华液单| 男的添女的下面高潮视频| 日本色播在线视频| av免费在线看不卡| 亚洲国产欧美人成| 两个人视频免费观看高清| 免费观看的影片在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩一区二区视频免费看| 国产毛片a区久久久久| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 成人无遮挡网站| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 青春草视频在线免费观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 久久热精品热| 免费观看a级毛片全部| 变态另类丝袜制服| 国产片特级美女逼逼视频| 真实男女啪啪啪动态图| 高清午夜精品一区二区三区 | 人人妻人人看人人澡| 日韩av不卡免费在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 成人午夜精彩视频在线观看| 91久久精品电影网| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久99久视频精品免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 51国产日韩欧美| 波多野结衣巨乳人妻| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久精品94久久精品| 99热全是精品| 色5月婷婷丁香| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日本免费a在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品久久久久久久久免| 99久久九九国产精品国产免费| 国产高清激情床上av| 在线观看午夜福利视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 国产一区二区激情短视频| 最近的中文字幕免费完整| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 精品日产1卡2卡| 黄色日韩在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 观看免费一级毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲精品粉嫩美女一区| 青春草国产在线视频 | 丰满乱子伦码专区| 女人被狂操c到高潮| 黄色配什么色好看| 99久久精品热视频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲在线自拍视频| 久久热精品热| 一级毛片久久久久久久久女| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费av观看视频| 日韩av不卡免费在线播放| 天美传媒精品一区二区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧洲日产国产| 久久久国产成人精品二区| 网址你懂的国产日韩在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲无线观看免费| 色噜噜av男人的天堂激情| 日韩高清综合在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 两个人视频免费观看高清| 又爽又黄a免费视频| 精品一区二区三区人妻视频| 我要看日韩黄色一级片| 成熟少妇高潮喷水视频| 全区人妻精品视频| 97在线视频观看| 干丝袜人妻中文字幕| 成年版毛片免费区| 黑人高潮一二区| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲,欧美,日韩| 国产高清激情床上av| 日本欧美国产在线视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产一区二区三区av在线 | 日韩人妻高清精品专区| 天美传媒精品一区二区| 99久久成人亚洲精品观看| av.在线天堂| 有码 亚洲区| 日韩一区二区三区影片| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲av男天堂| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 色5月婷婷丁香| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲人成网站高清观看| 此物有八面人人有两片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成人亚洲精品av一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品久久久久久久久av| 美女高潮的动态| 国产精品1区2区在线观看.| 国产av不卡久久| 日韩一区二区三区影片| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美精品一区二区大全| 黄色视频,在线免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 小说图片视频综合网站| 亚洲av成人av| 久久99热6这里只有精品| h日本视频在线播放| 久久精品影院6| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 波野结衣二区三区在线| 99在线人妻在线中文字幕| 美女高潮的动态| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕制服av| 国产午夜福利久久久久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 老司机福利观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 中文字幕熟女人妻在线| 免费黄网站久久成人精品| 日本黄大片高清| 亚洲av一区综合| 一本精品99久久精品77| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲av熟女| 精品久久久噜噜| 久久99精品国语久久久| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品野战在线观看| 最新中文字幕久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 内射极品少妇av片p| 美女黄网站色视频| 国产亚洲欧美98| 插逼视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人成网站在线播| 99久久久亚洲精品蜜臀av| av在线播放精品| 久久久精品大字幕| 免费观看a级毛片全部| 久久午夜亚洲精品久久| 一个人看视频在线观看www免费| 国产成人91sexporn| 麻豆乱淫一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩av不卡免费在线播放| av卡一久久| 久久这里有精品视频免费| 久久精品国产自在天天线| 国产片特级美女逼逼视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99热只有精品国产| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 嫩草影院新地址| 午夜精品一区二区三区免费看| av免费观看日本| 亚洲国产色片| 国产精品国产高清国产av| 成年女人永久免费观看视频| 中文字幕制服av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久这里有精品视频免费| 国产精品av视频在线免费观看| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久久大精品| 亚洲国产精品国产精品| 最好的美女福利视频网| 久久国内精品自在自线图片| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 少妇人妻精品综合一区二区 | 91久久精品国产一区二区成人| 赤兔流量卡办理| 久久精品国产清高在天天线| 美女高潮的动态| 1000部很黄的大片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲av男天堂| 如何舔出高潮| 最好的美女福利视频网| 国产淫片久久久久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩 亚洲 欧美在线| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲精品久久久com| 欧美激情久久久久久爽电影| or卡值多少钱| 亚洲三级黄色毛片| 久久99热这里只有精品18| 国产精品伦人一区二区| 日韩av不卡免费在线播放| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产精品合色在线| 综合色av麻豆| 国产色爽女视频免费观看| 久久精品国产自在天天线| 日本黄色片子视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久九九精品影院| 成年版毛片免费区| 观看美女的网站| 成人一区二区视频在线观看| 久久中文看片网| 特大巨黑吊av在线直播| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本一二三区视频观看| 色综合色国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 可以在线观看毛片的网站| 丰满的人妻完整版| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 老司机影院成人| 免费av不卡在线播放| 欧美日韩乱码在线| 看黄色毛片网站| 深夜精品福利| 亚洲第一电影网av| 男女下面进入的视频免费午夜| 性欧美人与动物交配| 2022亚洲国产成人精品| 成人av在线播放网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 成年免费大片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99久国产av精品国产电影| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久欧美国产精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜爱爱视频在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 中文欧美无线码| 熟女人妻精品中文字幕| 成年女人看的毛片在线观看| 在线观看午夜福利视频| 亚洲色图av天堂| 两个人视频免费观看高清| 国产伦在线观看视频一区| 九九热线精品视视频播放| 国产成人a区在线观看| 欧美bdsm另类| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜爱爱视频在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 热99在线观看视频| 精品日产1卡2卡| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲人成网站在线播| 美女大奶头视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 波多野结衣高清无吗| 一进一出抽搐动态| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久午夜亚洲精品久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩高清综合在线| 波野结衣二区三区在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产黄片视频在线免费观看| 内射极品少妇av片p| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲欧美成人精品一区二区| or卡值多少钱| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲国产欧美人成| 看片在线看免费视频| 麻豆国产97在线/欧美| 免费观看精品视频网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 成人综合一区亚洲| 国产亚洲91精品色在线| 日韩视频在线欧美| 国产av不卡久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久人人爽人人爽人人片va| 青春草视频在线免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 中国美白少妇内射xxxbb| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美成人精品一区二区| 激情 狠狠 欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 青春草亚洲视频在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 丰满乱子伦码专区| 在线播放无遮挡| 18禁在线播放成人免费| 国产伦一二天堂av在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 色5月婷婷丁香| 青青草视频在线视频观看| 国产伦在线观看视频一区| 免费看美女性在线毛片视频| 日本熟妇午夜| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 精品欧美国产一区二区三| 亚洲第一区二区三区不卡| 好男人在线观看高清免费视频| 天堂中文最新版在线下载 | 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美在线一区亚洲| 免费av不卡在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 可以在线观看的亚洲视频| 91久久精品电影网| 精品无人区乱码1区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产69精品久久久久777片| 深夜a级毛片| 人妻久久中文字幕网| 国产高清激情床上av| 亚洲第一电影网av| 亚洲av免费在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜久久久久精精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品女同一区二区软件| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 嫩草影院入口| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说 | av国产免费在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产精品一及| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国国产精品蜜臀av免费| 特级一级黄色大片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美三级亚洲精品| 在线免费十八禁| 久久久午夜欧美精品| 性欧美人与动物交配| 亚洲欧洲国产日韩| 日本一本二区三区精品| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲成av人片在线播放无| 一夜夜www| 波野结衣二区三区在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜激情欧美在线| 婷婷色综合大香蕉| 乱码一卡2卡4卡精品| 天堂√8在线中文| 人人妻人人看人人澡| 午夜亚洲福利在线播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 毛片女人毛片| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 在线免费观看的www视频| 亚洲三级黄色毛片| 99九九线精品视频在线观看视频| 白带黄色成豆腐渣| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚州av有码| a级一级毛片免费在线观看| 一级毛片电影观看 | 99视频精品全部免费 在线| 久久久久网色| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99热只有精品国产| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产精品成人久久小说 | 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美精品国产亚洲| av在线亚洲专区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日本黄大片高清| 免费在线观看成人毛片| 少妇被粗大猛烈的视频| av在线老鸭窝| 舔av片在线| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲人成网站在线播| 日韩三级伦理在线观看| 在线播放无遮挡| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久99热6这里只有精品| 亚洲欧洲国产日韩| 啦啦啦韩国在线观看视频| 乱人视频在线观看| .国产精品久久| 亚洲国产色片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 一级毛片电影观看 | 女同久久另类99精品国产91| 三级毛片av免费| 草草在线视频免费看| a级一级毛片免费在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产91av在线免费观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产黄片美女视频| 国产中年淑女户外野战色| 成人国产麻豆网| 看片在线看免费视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲不卡免费看| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 三级毛片av免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 波野结衣二区三区在线| 少妇熟女欧美另类| 久久久久久久久大av| 国产伦理片在线播放av一区 | 国语自产精品视频在线第100页| 国产成人aa在线观看| avwww免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 高清毛片免费看| 丰满乱子伦码专区| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久久久成人| 久久久久网色| 久久亚洲精品不卡| 在线播放无遮挡| 国产精华一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 可以在线观看毛片的网站| 天天躁日日操中文字幕| av天堂在线播放| 午夜久久久久精精品| 综合色丁香网| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| .国产精品久久| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲av免费在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99热网站在线观看| 欧美+日韩+精品| av女优亚洲男人天堂| 热99在线观看视频| 尾随美女入室| 欧美色视频一区免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品久久久久久久久久久久久| 床上黄色一级片| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产精品,欧美在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文亚洲av片在线观看爽| 一进一出抽搐动态| 美女黄网站色视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品久久视频播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 深爱激情五月婷婷| 亚洲色图av天堂| 夜夜夜夜夜久久久久| 草草在线视频免费看| 97超碰精品成人国产| 美女cb高潮喷水在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产在视频线在精品| 国产精品三级大全| 国产高清不卡午夜福利| 99在线视频只有这里精品首页| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产极品精品免费视频能看的| 成年av动漫网址| 国产成人福利小说| 插逼视频在线观看| 色播亚洲综合网| 悠悠久久av| 老师上课跳d突然被开到最大视频|