駱駝刺源產(chǎn)乳酸的嗜酸乳桿菌分離鑒定及菌種特性

應(yīng)璐+蔣慧

摘要：從駱駝刺青貯中分離到1株革蘭氏陽性桿菌，經(jīng)菌落形態(tài)特征鑒定、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析，鑒定為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。

關(guān)鍵詞：嗜酸乳桿菌;生理生化特性;16S rDNA

中圖分類號： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0355-02

收稿日期：2014-06-03

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30960259、31260562）;大學(xué)生創(chuàng)新項目（編號：20131075003）。

作者簡介：應(yīng) 璐（1978—），女，重慶人，碩士，講師，主要從事微生物教學(xué)、科研工作。E-mail：yl_tlm@163.com。

通信作者：蔣 慧，博士，教授，主要從事動物營養(yǎng)及飼料的教學(xué)、科研工作。E-mail：jianghui308@126.com。

青貯飼料中微生物系統(tǒng)主要包括乳酸菌、酵母菌、梭菌、霉菌及其他腐敗細(xì)菌，其中乳酸菌在青貯發(fā)酵中起主要作用[1]。駱駝刺（Alhagi sparsifolia Shap）是生長于荒漠、半荒漠地區(qū)的多年生豆科木質(zhì)化草本植物，具有耐干旱、耐鹽堿、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點[2]。豆科牧草蛋白質(zhì)含量高，可溶性碳水化合物含量低，緩沖能高，附著乳酸菌數(shù)目少，不容易成功青貯[3-4]。結(jié)果表明，無添加的高水分駱駝刺青貯容易成功，且駱駝刺與苜?；熨A能顯著提高苜蓿青貯品質(zhì)。近年來，抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，亟須尋找安全高效的替代品[5-7]。地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌是美國食品藥品管理局（FDA）、我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的飼用微生物[8]。新疆維吾爾自治區(qū)特殊的地理位置、地質(zhì)地貌造就了其干旱、鹽堿、極端高溫、極端低溫等多樣的生態(tài)環(huán)境，形成了具有獨特代謝途徑、遺傳背景的微生物類群[9]。在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，微生物與其宿主形成了相互依賴、相互制約的統(tǒng)一整體[10]。本研究探討新疆特殊生境微生物與其宿主駱駝刺青貯成功的關(guān)系，旨在為合理開發(fā)利用駱駝刺資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

疏葉駱駝刺采集于塔里木大學(xué)校園及其周邊，青貯3個月，備用。

1.2 方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的分離純化 將切碎的樣品用滅菌水進(jìn)行10倍梯度的稀釋，充分振蕩使其混勻，將混勻后的材料進(jìn)行倍比稀釋，稀釋度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，選取10-5、10-6、10-7 3個稀釋度，取菌懸液500 μL涂布于MRS培養(yǎng)基固體平板上，每個梯度稀釋液涂布3個平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，單菌落革蘭氏染色，陽性單菌落分離純化后MRS液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，20%滅菌甘油 -18 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 嗜酸乳桿菌16S rDNA序列分析

1.2.2.1 基因組DNA的提取 取1 mL 活化菌懸液，12 000 r/min 離心1 min，棄上清液，收集菌體。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增 將上述制備的細(xì)菌基因組DNA 作為PCR 擴(kuò)增的模板，采用16S rDNA通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′對16S rDNA細(xì)菌DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，正向、反向引物（2.5 mmol/L）各0.5 μL，rTaq（5 U/μL）酶0.3 μL，模板 1 μL，重蒸水 18.2 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.2.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測序、序列分析 使用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的膠回收試劑盒進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按說明書回收、純化目的片段。純度檢測后，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast同源比對，鑒定細(xì)菌種類。采用DNAstar軟件→Alige→One Pair→By Wilbuer-Lipman Method方法比對此菌株與桿菌的模式菌株16S rDNA的同源性。

1.2.3 嗜酸乳桿菌的生理生化特性鑒定 在16S rDNA序列分析基礎(chǔ)上進(jìn)行碳源同化試驗、氮源同化試驗、產(chǎn)乳酸試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、耐鹽試驗、耐酸試驗、溫度生長試驗[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落、細(xì)胞形態(tài)特征

從青貯3個月的疏葉駱駝刺中分離得到1株革蘭氏染色陽性細(xì)菌，命名為M1。菌體桿狀，單個、成對或短鏈形式，無芽孢，無莢膜，無鞭毛。不規(guī)則的乳白色圓形菌落，直徑1～2 mm，中央略凸，具光澤，表面光滑。

2.2 16S rDNA序列分析

對菌株M1進(jìn)行16S rDNA測序，序列1 530 bp，結(jié)果見圖1。該序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中已收錄序列進(jìn)行 Blast比對，初步確定其為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。采用DNA Star軟件分析該序列與嗜酸乳桿菌的模式菌株ATCC 4356 （NCBI登錄號：AY773947）16S rDNA基因序列相似性達(dá)99.7%。

2.3 生理生化特征

根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果對M1菌株進(jìn)行了生理生化鑒定。由表1可知，M1菌株可以同化碳源α-D-葡萄糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖，不能同化碳源龍膽二糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、麥芽三糖、D-松三糖、麥芽糖醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-木糖、丙三醇、山梨醇、木糖醇、松二糖，可以同化氮源（NH4）2SO4 、KNO3。由表2可知，M1菌株的產(chǎn)乳酸試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗均呈陽性;15～35 ℃均能生長，45 ℃停止生長;弱酸性到中性條件下均能生長，強(qiáng)酸性條件下停止生長;2%～10% NaCl條件下均能正常生長，12% NaCl停止生長。endprint

表1 菌株M1的碳源、氮源同化試驗結(jié)果

碳源同化 氮源同化

項目 結(jié)果 項目 結(jié)果 項目 結(jié)果 項目 結(jié)果 項目 結(jié)果

α-D-葡萄糖 + L-鼠李糖 - 麥芽糖醇 - 丙三醇 - （NH4）2SO4 +

龍膽二糖 - D-果糖 + 乳糖 + 山梨醇 - KNO3 +

纖維二糖 + 蔗糖 + D-甘露醇 - 木糖醇 -

D-半乳糖 + 麥芽三糖 - D-甘露糖 - 麥芽糖 +

L-山梨糖 - D-松三糖 - D-木糖 - 松二糖 -

注：“+”表示陽性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)，下表同。

表2 菌株的生理生化試驗結(jié)果

項目 結(jié)果 項目 結(jié)果 項目 結(jié)果

5 ℃ + pH值為2 - 2%NaCl +

25 ℃ + pH值為3 - 4%NaCl +

35 ℃ + pH值為4 + 6%NaCl +

45 ℃ - pH值為5 + 8% NaCl +

產(chǎn)乳酸試驗 + pH值為6 + 10% NaCl +

接觸酶試驗 + pH值為7 + 12% NaCl -

明膠液化試驗 + 淀粉水解試驗 +

3 結(jié)論

從駱駝刺青貯中分離到1株革蘭氏陽性桿菌，經(jīng)菌落形態(tài)特征鑒定、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析，鑒定為嗜酸乳桿菌。

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