白芨種子無菌萌發(fā)特性

李雨晴+楊嘉偉+王康才+梁永富+陳紅麗+徐益祥+夏天爽

摘要：為探討白芨[B.striata（Thunb.）Teichb.f.]種子無菌萌發(fā)適宜條件，采用1/2 MS、MS添加不同激素、生物添加劑，以及光暗處理進(jìn)行白芨種子萌發(fā)試驗。結(jié)果表明：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA有利于種子萌發(fā);1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁有利于誘導(dǎo)原球莖;暗培養(yǎng)降低白芨種子萌發(fā)率，白芨種子萌發(fā)后，其幼苗在光照條件下生長緩慢。

關(guān)鍵詞：白芨;無菌萌發(fā);發(fā)芽勢;

中圖分類號： S567.23+9.04 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0253-02

收稿日期：2014-05-22

基金項目：江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)項目（編號：R0201100292）。

作者簡介：李雨晴（1991—），女，碩士研究生，主要從事藥用植物栽培與生理研究。E-mail：2013804133@njau.edu.cn。

通信作者：王康才，教授，主要從事藥用植物栽培與生理研究。E-mail：wangkc@njau.edu.cn。

白芨[Bletilla striata （Thunb.）Teichb.f.]為蘭科白芨屬多年生草本植物，以干燥塊莖入藥，性微寒，味苦、甘、澀，具有補(bǔ)肺、止血、散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌、斂瘡等功效，主治咳血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結(jié)核咳血、潰瘍病出血等癥[1]。白芨種子細(xì)小、無胚，在野生條件下很難萌發(fā)。人工采挖導(dǎo)致白芨野生資源緊缺，迫切需要進(jìn)行人工栽培。白芨蒴果包含上萬粒種子，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對白芨進(jìn)行無菌萌發(fā)，可以提高其萌發(fā)率，得到大量組培苗，是解決傳統(tǒng)分株繁殖效率低的重要手段[2-5]。為進(jìn)一步優(yōu)化白芨種子的發(fā)芽條件，本研究探討白芨無菌萌發(fā)條件及幼苗生長特性，以期為白芨快速繁殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白芨于2013年8月采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材試驗大棚，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所王康才教授鑒定為白芨的蒴果。

1.2 方法

白芨蒴果采集后，先用洗滌劑漂洗蒴果表面，再用流水沖洗30 min。在超凈工作臺上用75%乙醇浸沒30 s，無菌水沖洗后經(jīng)HgCl2消毒15 min，其間不停搖動，無菌水沖洗3～4遍，用無菌濾紙吸干白芨蒴果表面水分。蒴果縱剖，將種子均勻抖落在培養(yǎng)基表面?；九囵B(yǎng)基為1/2 MS，均添加蔗糖 30 g/L、瓊脂粉6 g/L（除特殊說明而外）。培養(yǎng)基滅菌前加入不同生物添加劑（馬鈴薯提取液、椰汁）以及不同濃度激素（NAA、6-BA），設(shè)置5×5完全隨機(jī)區(qū)組。培養(yǎng)基高溫滅菌前調(diào)節(jié)pH值至5.6，121 ℃下滅菌30 min，每處理接種5瓶，每瓶300～400粒種子。暗培養(yǎng)以黑暗條件下培養(yǎng)30 d后置于光下，其余處理為12 h/12 h光暗培養(yǎng)，照度2 000～2 500 lx，培養(yǎng)溫度均為（25±1） ℃。統(tǒng)計各處理白芨種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢，原球莖誘導(dǎo)率及株高。發(fā)芽勢以培養(yǎng)20 d時的萌發(fā)率計，幼苗株高以培養(yǎng)50 d時計。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下白芨種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育過程

白芨種子接種至各不同培養(yǎng)基上1周后開始膨大，顏色由灰白轉(zhuǎn)綠。2周后可見葉芽從膨大的種胚一端頂出，添加高濃度激素的培養(yǎng)基上葉芽粗壯。3周后，葉芽變綠。數(shù)周后葉片展開。添加椰汁的培養(yǎng)基上葉芽生長緩慢，種胚持續(xù)膨大形成原球莖。培養(yǎng)50 d，原球莖誘導(dǎo)率分別達(dá)87.3%、92.3%，未見葉片展開（圖1）。培養(yǎng)60 d，添加激素的培養(yǎng)基中白芨幼苗莖基粗壯，葉片向上展開，未見生根。1/2 MS培養(yǎng)基上白芨葉片自基部展開，葉片向四周展開，葉尖微垂，少數(shù)植株生根。暗培養(yǎng)的白芨種子萌發(fā)率低，種胚膨大后不形成原球莖，直接萌發(fā)為細(xì)弱的幼苗;幼苗移至光下后，生長十分緩慢。

2.2 基本培養(yǎng)基、生物添加劑及光周期對白芨種子萌發(fā)的影響

由表1可見，培養(yǎng)40 d，除暗培養(yǎng)處理外，各培養(yǎng)基上白芨種子發(fā)芽率均可達(dá)到90%以上。與1/2 MS相比，添加 1.0 mg/L NAA能明顯提高白芨種子發(fā)芽率并促進(jìn)幼苗生長。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基時，白芨種子發(fā)芽勢高，生活力更旺盛。以MS為基本培養(yǎng)基有利于提高白芨幼苗株高，促進(jìn)其生長。馬鈴薯提取液對白芨萌發(fā)促進(jìn)作用較小，甚至抑制了幼苗的生長。

2.3 激素對白芨種子無菌萌發(fā)的影響

不同濃度激素處理對白芨種子萌發(fā)有顯著影響。添加1.0 mg/L NAA、1.6 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，白芨種子發(fā)芽勢較高（94.4%），幼苗株高達(dá)1.190 cm;添加0.2 mg/L NAA及1.2 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，白芨種子發(fā)芽勢最低（186%），幼苗較矮（0.104 cm）（表2、表3）。

表1 不同處理對白芨種子萌發(fā)的影響

培養(yǎng)基

發(fā)芽率（%）

20 d 30 d 40 d

株高

（cm）

1/2 MS+1.0 mg/L NAA 88.2±1.924ab 95.4±1.673a 97.0±2.449a 0.348±0.015b

MS+1.0 mg/L NAA 78.4±2.074c 96.6±3.209a 97.6±1.140a 0.398±0.016a

1/2 MS+馬鈴薯提取液 65.0±1.581d 83.4±2.510b 91.4±1.140b 0.252±0.036c

1/2 MS+20%椰汁 86.6±2.702b 96.8±1.304a 97.6±1.517a 0.206±0.021dendprint

1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁 89.8±1.304a 95.6±1.517a 96.2±2.168a 0.352±0.041b

1/2 MS暗培養(yǎng) 27.4±1.817f 45.8±1.095d 46.4±3.435c 0.112±0.013e

1/2 MS 60.8±1.924e 79.4±3.715c 90.2±0.837b 0.368±0.036ab

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

表2 不同激素對白芨種子發(fā)芽勢的影響

6-BA濃度

（mg/L）

發(fā)芽勢（%）

NAA濃度0.2 mg/L NAA濃度0.4 mg/L NAA濃度0.6 mg/L NAA濃度0.8 mg/L NAA濃度1.0 mg/L

0.4 44.2±4.970k 60.2±3.421i 42.0±3.606k 81.2±6.496cd 87.2±3.563b

0.8 35.2±4.764l 42.2±3.271k 53.0±4.301j 71.2±4.970fg 82.0±2.828cd

1.2 18.6±1.517n 24.6±2.302m 31.2±1.483l 44.4±2.074k 59.6±2.966i

1.6 74.6±2.702f 79.8±2.774de 84.6±3.782bc 89.0±2.915b 94.4±1.673a

2.0 64.8±2.280h 69.8±2.775g 75.6±2.966ef 73.0±3.240fg 79.6±5.030de

注：所有數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

表3 不同激素對白芨幼苗株高的影響

6-BA濃度

（mg/L）

株高（cm）

NAA濃度0.2 mg/L NAA濃度0.4 mg/L NAA濃度0.6 mg/L NAA濃度0.8 mg/L NAA濃度1.0 mg/L

0.4 0.094±0.038j 0.232±0.029ghi 0.386±0.058f 0.436±0.047f 1.050±0.156b

0.8 0.296±0.028g 0.312±0.038g 0.392±0.071f 0.448±0.048f 0.812±0.061d

1.2 0.104±0.011j 0.198±0.037i 0.292±0.026gh 0.712±0.037e 0.874±0.113d

1.6 0.212±0.026hi 0.242±0.038ghi 0.272±0.029ghi 0.970±0.051c 1.190±0.042a

2.0 0.242±0.018ghi 0.402±0.026f 0.806±0.111d 0.834±0.043d 1.000±0.066bc

注：所有數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4 不同激素對白芨萌發(fā)影響的多重比較

由表4可知，白芨種子發(fā)芽勢、幼苗株高在一定范圍內(nèi)隨著6-BA、NAA濃度的增大而升高。6-BA濃度達(dá)1.6 mg/L時，白芨種子發(fā)芽勢最大。與添加NAA的培養(yǎng)基相比，添加6-BA白芨種子發(fā)芽勢極差較高，但幼苗株高極差偏低，表明NAA對白芨種子發(fā)芽勢影響較6-BA小，但對幼苗生長促進(jìn)作用較強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

蘭科植物種子細(xì)小，成熟時種皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器退化消失，成為死細(xì)胞[6]。胚發(fā)育不完全，缺乏供給營養(yǎng)成分的胚乳，自然條件下難以萌發(fā)。白芨為陸生蘭類，陸生蘭為適應(yīng)其生長環(huán)境，其種子具有厚種皮及含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)性質(zhì)[7]，其種子發(fā)芽較氣生蘭更困難。無菌培養(yǎng)白芨種子，必須提供其萌發(fā)所需的各種物質(zhì)，椰汁、馬鈴薯提取液等生物添加劑能提高發(fā)芽率、發(fā)芽速度[6]，這與本研究結(jié)果基本相符。本試驗發(fā)現(xiàn)，椰汁能誘導(dǎo)白芨種子直接形成原球莖，旦抑制幼苗生

表4 6-BA、NAA濃度對白芨萌發(fā)的影響

激素 濃度（mg/L） 發(fā)芽勢（%） 株高（cm）

6-BA 0.4 62.96±19.379c 0.435±0.347b

0.8 56.72±18.281d 0.452±0.198b

1.2 35.68±15.146e 0.436±0.312b

1.6 84.48±7.512a 0.577±0.427a

2.0 72.56±6.001b 0.657±0.297a

極差 48.80百分點(diǎn) 0.222

NAA 0.2 47.48±20.821d 0.185±0.089e

0.4 55.32±20.326c 0.277±0.080d

0.6 57.28±20.713c 0.430±0.207c

0.8 71.76±15.870b 0.680±0.219b

1.0 80.56±12.282a 0.985±0.162a

極差 33.08百分點(diǎn) 0.800

注：同一激素處理同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

長，這可能與椰汁含有的激素種類和濃度有關(guān)。生長素、細(xì)胞分裂素在種子萌發(fā)過程中起著重要作用，尤以后者作用更為明顯[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA對白芨種子發(fā)芽的促進(jìn)作用較NAA更為明顯，這與前人研究相符。MS是成分比較完全的

培養(yǎng)基，1/2 MS雖與之成分相同，但大量元素減半。本研究結(jié)果表明，1/2 MS作為種子萌發(fā)培養(yǎng)基可以提高其發(fā)芽勢，猜測高濃度鹽離子影響細(xì)胞滲透勢導(dǎo)致發(fā)芽勢降低。發(fā)芽后應(yīng)盡快將幼苗轉(zhuǎn)接至MS培養(yǎng)基上壯苗，添加激素輔助其幼苗繼續(xù)生長。光是影響種子萌發(fā)的重要因素之一，本研究發(fā)現(xiàn)，白芨種子萌發(fā)初期需光，暗培養(yǎng)的白芨種子萌發(fā)率低，轉(zhuǎn)至光下萌發(fā)率未見顯著增長，但可在無激素培養(yǎng)基上維持幼苗期長達(dá)數(shù)月，直至添加激素打破其生長停滯。這一發(fā)現(xiàn)對保存白芨種質(zhì)及人工調(diào)控溫室白芨苗生長期具有重大意義。綜上所述，在12 h/12 h光周期下，考慮以1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA為萌發(fā)培養(yǎng)基較為適宜;以1/2MS+20%椰汁為培養(yǎng)基獲得白芨原球莖。白芨種子萌芽初期細(xì)小，不宜轉(zhuǎn)接，因此對于種子萌發(fā)培養(yǎng)基不僅要評價其提高種子活力的能力，而且要考慮其促進(jìn)幼苗生長的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[2]周至明，黃程生，彭麗麗，等. 白芨人工種植初步研究[J]. 中藥材，2006，29（1）：7-8.

[3]張亦誠.白芨的生物特性及栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)科技與信息，2007（11）：45.

[4]韓學(xué)儉.白芨藥用及其栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2004，15（10）：31-32.

[5]陸善旦.白芨種植技術(shù)[J]. 農(nóng)村新技術(shù)，2008（19）：4-5.

[6]郭順星，徐錦堂.蘭科植物種子無菌萌發(fā)的研究[J]. 種子，1990（5）：36-37，58.

[7]Plant B，Shrestha S，Prandhan S. In vitro seed germination and seeding development of Phaius tancarvilleae（L′Her.） Blum[J]. Sci World，2011，9 （9）：50-52.

[8]Thompson D I，Edwards T J，Staden J V. Evaluating asymbiotic seed culture methods and establishing Disa （Orchidaceae） germinability in vitro：relationships，requirements and first-time reports[J]. Plant Growth Regul，2006，49（2/3）：269-284.endprint