中藥復(fù)方多糖對雞紅細胞免疫功能和SOD活性的影響

商云霞+朱曉慶+谷新利+李效振+喬海博+賈書紅+張東升

摘要：將300羽雄性良鳳青腳麻雞隨機分為6組，即對照組、鹽酸左旋咪唑組、黃芪多糖組、高、中、低劑量一定純度中藥復(fù)方多糖組，每組50羽。分別于8日齡皮下注射生理鹽水及鹽酸左旋咪唑、黃芪多糖和不同劑量的一定純度中藥復(fù)方多糖，連續(xù)7 d，在免疫后8、14、21、35、42 d采血，測定外周血中紅細胞C3b受體花環(huán)率、紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)率、SOD含量。試驗結(jié)果表明，黃芪多糖和一定純度中藥復(fù)方多糖均能顯著升高紅細胞-C3b花環(huán)率和紅細胞-IC花環(huán)率，增強SOD活性，最佳純度中藥復(fù)方多糖組免疫效果優(yōu)于黃芪多糖，以中劑量中藥復(fù)方多糖效果最好。

關(guān)鍵詞：雞;中藥復(fù)方多糖;黃芪多糖;鹽酸左旋咪唑;紅細胞免疫功能;超氧化物歧化酶

中圖分類號： S858.312.4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0214-03

收稿日期：2014-12-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30960291）。

作者簡介：商云霞（1965—），女，新疆奎屯人，高級實驗師，研究方向為動物疫病防治。E-mail：shangyunxia@shzu.edu.cn。

中醫(yī)藥與免疫學(xué)的關(guān)系極為密切。我國古代就已認識到疾病的發(fā)生和機體的抵抗力（免疫力）密切相關(guān)，在世界上最早應(yīng)用免疫學(xué)的方法防治疾病。免疫學(xué)對中醫(yī)藥的發(fā)展具有極其重要的推動作用，在闡明中醫(yī)藥防病、治病機理，研究中藥有效成分，提高中藥臨床療效等方面都具有十分重要的意義。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)許多中草藥中的多糖成分能通過促進淋巴細胞增殖、轉(zhuǎn)化和抗體生成，增加紅細胞數(shù)量，升高紅細胞-C3b花環(huán)率、紅細胞-IC花環(huán)率及紅細胞補體受體1（CR1）數(shù)量和活性等方式來提高機體免疫力，改善機體免疫狀態(tài)。并且紅細胞上的多種免疫相關(guān)的物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（SOD）、CR1、CR3[1]等分工合作，使紅細胞具有識別、黏附、濃縮抗體和清除免疫復(fù)合物、增加LAK細胞數(shù)量、激活NK細胞，參與機體免疫調(diào)控作用[2]。與此同時，從中草藥提取的粗提物中含有大量雜質(zhì)，影響在應(yīng)用時的穩(wěn)定性[3]。本研究通過比較已證實能增強小鼠免疫力的經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后得到的對小鼠免疫增強效果最好的一定純度中藥復(fù)方多糖（cCHMPS）、單味中藥多糖黃芪多糖（APS）、人工合成免疫增強劑鹽酸左旋咪唑（LM）對雞紅細胞C3b受體花環(huán)率、紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)率和SOD活性的動態(tài)變化，為篩選出一定純度中藥復(fù)方多糖的最適免疫增強劑量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

中藥復(fù)方由黨參、山植、熟地、川芎、何首烏、當歸等11味中藥組成，各單味藥均購自新疆石河子市醫(yī)藥公司;中藥復(fù)方多糖粗提物是從中藥復(fù)方中采用水提-醇沉法提取。純化后中藥復(fù)方多糖是中藥復(fù)方多糖粗提物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得。多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，純化后中藥復(fù)方多糖的含糖量為77.10%。用滅菌蒸餾水將純化后中藥復(fù)方多糖配制成高、中、低（50、25、12.5 mg/mL）3個劑量濃度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后4 ℃儲存?zhèn)溆?黃芪多糖由石河子大學(xué)化工學(xué)院采用水提-醇沉法提取，含糖量為29.42%，用滅菌蒸餾水配制成25 mg/mL的劑量濃度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后4 ℃儲存?zhèn)溆?鹽酸左旋咪唑注射劑購自上海申亞動物保健品有限公司;雞新城疫疫苗（La Sota株和CS2株）購自新疆石河子市八師獸醫(yī)站;凍干補體致敏酵母多糖和未致敏酵母多糖由第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院免疫室提供;雞超氧化物歧化酶試劑盒（ELISA）購自上海藍基生物科技有限公司。

1.2 動物及分組

一定純度中藥復(fù)方多糖組（1）高劑量（cCHMPSH 50 mg/mL）;（2）中劑量（cCHMPSM 25 mg/mL）;（3）低劑量（cCHMPSL 12.5 mg/mL）;（4）黃芪多糖組（25 mg/mL APS）;（5）鹽酸左旋咪唑組50 mg/mL LM唑;（6）生理鹽水組（對照）。1日齡雄性良鳳青腳麻雞由新疆石河子市某養(yǎng)雞場提供，臨床檢查健康。將試驗雞于7日齡時隨機分為6組，每組50羽。于8日齡分別皮下注射，0.2 mL/羽，連續(xù)注射7 d。

所有試驗雞于7日齡時用雞新城疫活疫苗（La Sota株）滴鼻、點眼免疫，27日齡用雞新城疫疫苗（CS2株）進行二免。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼料購自新疆天康飼料廠，0～4周齡，飼料中粗蛋白質(zhì)≥20.0%、粗纖維≤4.5%、鈣0.80%～1.30%、總磷≥060%、食鹽0.30%～0.80%;5～8周齡，飼料中粗蛋白質(zhì)≥19.0%、粗纖維≤5.5%、鈣0.70%～1.20%、總磷≥0.60%、食鹽030%～0.80%。

6組雞采用相同的飼養(yǎng)方法、飼養(yǎng)條件、環(huán)境、飼料品質(zhì)及飼養(yǎng)管理進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 紅細胞C3b受體花環(huán)率測定 每組隨機抽取5羽試驗雞，于免疫后8、14、21、28、35、42 d翅靜脈采血0.1 mL，按照文獻[4-6]方法進行致敏酵母多糖和紅細胞懸液的制備，紅細胞C3b受體花環(huán)數(shù)的計數(shù)和紅細胞C3b受體花環(huán)百分率的計算。

1.4.2 紅細胞IC花環(huán)率測定 把“1.4.1”節(jié)中的致敏酵母多糖改為酵母多糖，其他操作相同，計算出紅細胞IC花環(huán)百分率。

1.4.3 超氧化物歧化酶（SOD）含量測定 每組隨機抽取5羽試驗雞，于免疫后8 d心臟采血，14、21、28、35、42 d翅靜脈采血，常規(guī)分離血清。用SOD ELISA檢測試劑盒在酶標儀450 nm處檢測D值，并繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算雞SOD的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析endprint

各項免疫指標數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”（x±s）表示，用SPSS 13.0進行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅細胞C3b花環(huán)率的動態(tài)變化

不同日齡雛雞紅細胞C3b受體（RBC-C3b）花環(huán)率測定結(jié)果見表1。由表1可知，不同處理均能不同程度地提高雞RBC-C3b花環(huán)率。并且首免后8 d，cCHMPSM組、cCHMPSH組RBC-C3b顯著高于對照組和LM組;首免后14 d，cCHMPSM組極顯著高于對照組，顯著高于LM組;首免后 21 d，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組，顯著高于APS組，cCHMPSH組、cCHMPSL組顯著高于對照組和LM組;首免后28 d，cCHMPSL組顯著高于對照組，cCHMPSM組極顯著高于對照組，顯著高于LM組;首免后35 d，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組，顯著高于APS組，cCHMPSH組顯著高于對照組和LM組;免疫后42 d，APS組極顯著高于對照組，顯著高于LM組，各劑量cCHMPS組均極顯著高于對照組和LM組。

表1 不同處理紅細胞C3b花環(huán)率的動態(tài)變化

處理

首免后不同時間紅細胞C3b花環(huán)率（%）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 6.63±0.28bA 7.20±0.72abAB 8.03±0.42bcAB 7.90±0.53abcABC 7.80±0.26bcAB 7.43±0.09cC

cCHMPSM 6.70±0.25bA 8.07±0.23bB 8.93±0.32cB 8.63±0.43cBC 8.73±0.66cB 7.77±0.44cC

cCHMPSL 6.23±0.20abA 7.10±0.53abAB 7.90±0.32bcAB 8.17±0.50bcABC 7.60±0.29abcAB 7.33±0.54cC

APS 6.17±0.50abA 7.30±0.53abAB 7.70±0.52abAB 7.90±0.12abcABC 7.37±0.09abAB 7.00±0.06bcBC

LM 5.60±0.32aA 6.30±0.25aB 6.77±0.19aA 7.30±0.47abAB 6.23±0.64aA 5.63±0.12abAB

對照 5.47±0.23aA 6.07±0.22aA 6.67±0.34aA 6.73±0.33aA 6.30±0.46aA 5.40±0.47aA

注：同列數(shù)據(jù)后小寫、大寫字母不同者分別表示差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）。表2、表3同。

2.2 紅細胞IC花環(huán)率的動態(tài)變化

不同日齡雛雞紅細胞免疫復(fù)合物（RBC-IC）花環(huán)率測定結(jié)果見表2。由表2可知，不同處理均能不同程度地提高雞RBC-IC花環(huán)率。首免后8 d，cCHMPSM組RBC-IC花環(huán)率顯著高于對照組和LM組;首免后14 d，cCHMPSM組極顯著高于對照組、LM組和APS組，顯著高于cCHMPSL組;首免后21 d，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組，顯著高于APS組，cCHMPSH組和cCHMPSL組極顯著高于對照組和LM組;首免后28 d，APS組顯著高于對照組，cCHMPSL組顯著高于對照組和LM組，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組，顯著高于cCHMPSL組和APS組，cCHMPSH組極顯著高于對照組和LM組;首免后35 d，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組，cCHMPSH組顯著高于對照組;首免后42 d，APS組顯著高于對照組，cCHMPSL組顯著高于對照組和LM組，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組，cCHMPSH組顯著高于對照組。

表2 不同處理紅細胞IC花環(huán)率的動態(tài)變化

處理

首免后不同時間紅細胞IC花環(huán)率（%）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 8.63±0.35abA 9.53±0.28abcAB 10.63±0.46bcB 10.80±0.32abcABC 9.67±0.43bcAB 8.83±0.38bcAB

cCHMPSM 8.93±0.23bA 10.70±0.46cB 11.10±0.36cB 11.73±0.61cC 10.43±0.33cC 9.87±0.17cC

cCHMPSL 8.47±0.28abA 9.27±0.33abAB 10.33±0.30bcB 10.17±0.23cAB 9.40±0.67abcABC 9.10±0.12ccAB

APS 8.10±0.36abA 8.83±0.52aA 9.67±0.43abAB 9.97±0.47abcABC 9.27±0.19abcABC 8.93±0.35bcAB

LM 7.93±0.33aA 8.53±0.34aA 8.80±0.31aA 8.93±0.43abAB 8.40±0.72abAB 8.03±0.48abAB

對照 7.77±0.23aA 8.37±0.44aA 8.63±0.24aA 8.67±0.15aA 8.17±0.32aA 7.67±0.39aA

2.3 SOD活性的動態(tài)變化

不同日齡雛雞血清中SOD含量結(jié)果見表3。由表3可知，首免后14 d，APS組中SOD含量極顯著高于其他各組，cCHMPSH組顯著高于LM組，cCHMPSM組顯著高于對照組和LM組;首免后21 d，APS組極顯著高于對照組、LM組，顯著高于cCHMPSH組和cCHMPSL組，cCHMPSH組、cCHMPSL組顯著高于對照組和LM組，cCHMPSM組極顯著高于對照組和LM組;首免后28 d，不同多糖組均極顯著高于對照組和LM組，cCHMPSM組顯著高于APS組和cCHMPSL組;首免后 35 d，各劑量cCHMPS組極顯著高于其他各組;首免后42 d，各劑量cCHMPS組極顯著高于其他各組，cCHMPSH組和cCHMPSM組顯著高于cCHMPSL組。endprint

3 討論與結(jié)論

3.1 LM、APS和cCHMPS對雛雞紅細胞免疫功能的影響

Nelson發(fā)現(xiàn)紅細胞具有免疫黏附作用[7]后，西方國家隨即對其進行了深入研究。1981年Siegel等在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了紅細胞的多種免疫功能，提出了“紅細胞免疫系

表3 不同處理組SOD含量的動態(tài)變化

處理

首免后不同時間SOD含量（pg/mL）

8 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d

cCHMPSH 56.29±2.63aA 67.69±4.34abAB 75.59±4.18bcABC 91.03±2.54bcB 141.27±13.96bB 173.88±8.69cC

cCHMPSM 56.36±2.16aA 68.52±2.88bAB 78.66±2.55cdBC 93.29±3.97cB 154.21±14.59bB 176.22±11.95cC

cCHMPSL 60.64±3.23aA 66.57±2.18abAB 74.40±2.41bcABC 82.75±3.85bB 140.41±10.91bB 144.85±6.82bBC

APS 64.26±4.84aA 82.24±1.79cC 88.66±3.24dC 82.21±4.57bB 77.21±1.77aA 64.48±2.12aA

LM 56.42±2.47aA 57.01±2.65aA 63.62±3.46aA 65.43±2.66aA 67.22±2.36aA 59.32±3.21aA

對照 54.91±4.15aA 57.92±1.83abAB 59.46±1.97aA 60.73±1.11aA 61.45±1.37aA 59.60±2.70aA

統(tǒng)”的概念[8]，從而更新了人們對紅細胞功能的認識，促進了紅細胞免疫研究工作的迅速發(fā)展。眾多研究表明，紅細胞具有清除循環(huán)免疫復(fù)合物、增強吞噬細胞的吞噬功能、調(diào)控T淋巴細胞和淋巴因子、識別、儲存和提呈抗原等作用[9-10]。紅細胞的這些免疫功能主要是通過免疫黏附來實現(xiàn)，紅細胞膜上的CR1（即C3b受體）是免疫黏附的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此判斷紅細胞免疫功能的主要指標為CR1活性。郭峰在紅細胞免疫的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究方面取得了許多突破性進展，建立了一系列紅細胞免疫功能的監(jiān)測方法[5]。目前常用C3b受體花環(huán)試驗、紅細胞免疫復(fù)合物（IC）花環(huán)、血清紅細胞免疫黏附促進因子測定等方法測定紅細胞膜上CR1活性。研究表明，許多中藥復(fù)方制劑和多糖可顯著提高紅細胞免疫水平[11-13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，高、中、低劑量一定純度中藥復(fù)方多糖、黃芪多糖組與對照組相比，均能提高雛雞紅細胞-C3b受體花環(huán)率和紅細胞-IC受體花環(huán)率，增強紅細胞膜上C3b活性，并且中劑量一定純度中藥復(fù)方多糖組的效果最佳。而鹽酸左旋咪唑組與對照組相比無明顯差別，原因可能是鹽酸左旋咪唑具有促進免疫細胞增殖，增強機體抗體水平等免疫調(diào)節(jié)作用，而對紅細胞無明顯免疫調(diào)節(jié)作用。

3.2 LM、APS和cCHMPS對雛雞抗氧化能力的影響

動物機體在生命活動的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生各種活性氧自由基，它們獨立存在含有1個或多個不成對電子或分子[14]。正常情況下，機體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除保持著一種動態(tài)平衡，當該平衡一旦被打破，機體內(nèi)急劇積累的氧自由基便會對細胞產(chǎn)生巨大的破壞作用，使核酸主鍵斷裂、氫鍵破壞、蛋白質(zhì)失活和降解，脂質(zhì)發(fā)生過氧化等[15]，導(dǎo)致細胞壞死、細胞程序性死亡、過敏反應(yīng)、癌變或其他病理過程[16]。SOD是活性氧清除反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶，它能將超氧物陰離子自由基快速歧化為過氧化氫（H2O2）和分子氧，之后H2O2在過氧化氫酶（CAT）、各種過氧化物酶（如APX）和抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友酰诒Ｗo細胞免受氧化損傷過程中具有十分重要的作用[17]。血液中SOD活性的高低可間接反映機體清除活性氧自由基的能力，用來衡量機體抗氧化作用的大小。試驗證明，植物多糖能通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性來發(fā)揮抗氧化作用[18]，左旋咪唑能通過在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物（d）-2-氧-3（-2-硫乙基）-5-苯丙硫咪唑啉（OMPI）與活細胞內(nèi)的氧化產(chǎn)物結(jié)合，清除活性氧自由基，起到保護細胞的作用[19]。本試驗結(jié)果表明，高、中、低劑量一定純度中藥復(fù)方多糖、黃芪多糖與對照相比，均能顯著提高雛雞血清中SOD含量。表明純化后的中藥復(fù)方多糖和黃芪多糖均具有明顯抗氧化活性，本結(jié)論與徐小芳等報道的中藥復(fù)方多糖和黃芪多糖均能顯著升高血清中SOD含量，提高雞抗氧化能力的試驗結(jié)果[20]一致。而鹽酸左旋咪唑?qū)﹄r雞血清中SOD含量影響不大，可能其抗氧化機制與代謝產(chǎn)物OMPI有關(guān)，而與提高機體SOD含量無關(guān)。

本試驗通過LM、APS和cCHMPS對紅細胞免疫功能和SOD活性的比較，驗證了中藥多糖能夠通過增強紅細胞免疫黏附力和SOD活性提高機體抵抗病原的能力?？傮w而言，各劑量一定純度中藥復(fù)方多糖，尤其是中劑量一定純度中藥復(fù)方多糖的免疫增強效果均優(yōu)于黃芪多糖，表明中藥復(fù)方多糖各組分間有協(xié)同增效作用，可大大提高中藥復(fù)方多糖的免疫活性，多糖的生物活性不是劑量越大越好，提高劑量并不能增強其免疫活性。

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