酵母脂肪酶酶促合成蝦青素琥珀酸酯及優(yōu)化

尹春華，韓燁，呂樂，許倩倩，閆海

（北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物科學(xué)與工程系，北京100083）

引 言

蝦青素 （3，3′－二羥基－4，4′－二酮基－β－胡蘿卜素），是最早從河螯蝦外殼、牡蠣和鮭魚中發(fā)現(xiàn)的一種紅色類胡蘿卜素。蝦青素是自然界抗氧化性最強的物質(zhì)，其抗氧化能力是維生素E的1000倍，有 “超級維生素E”之稱［1］，可有效清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基［2］，具有增強細(xì)胞再生能力、保護細(xì)胞和DNA的健康［3］，維持機體平衡等功能［4］。并且蝦青素是唯一能通過血腦屏障的抗氧化劑［5］，可抑制腦血栓的形成。目前蝦青素已廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)療保健和化妝品等領(lǐng)域。但是，蝦青素化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，對熱、氧、自然光和紫外線敏感，容易發(fā)生氧化而降解，這給蝦青素的儲存、使用等帶來很多不便［6］。蝦青素酯化可彌補蝦青素在這一方面的不足，許多研究表明蝦青素酯不僅具有蝦青素的生理活性，而且隨著修飾基團的加入，賦予了蝦青素酯一些新的功能性質(zhì)［7－8］，如蝦青素脂肪酸酯更易被小腸吸收，蝦青素辛酸單酯和二酯在肝組織中具有更高的累積速率［8］。

目前，蝦青素酯主要由化學(xué)法合成［9］，采用堿金屬烷醇鹽等有機堿為催化劑，酰氯為?；噭?，反應(yīng)過程復(fù)雜，污染大，反應(yīng)溫度高 （80～120℃），反應(yīng)過程中蝦青素易受熱異構(gòu)化或降解降低反應(yīng)產(chǎn)率，產(chǎn)物的分離純化復(fù)雜且產(chǎn)品的生物活性不高。與化學(xué)合成法相比，酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、催化專一性強等優(yōu)點［8，10－12］。Sumida等［8］研究了酶法催化蝦青素中鏈脂肪酸酯的合成。反應(yīng)以辛酸和蝦青素為底物，2 mg蝦青素在80mg脂肪酶催化下，反應(yīng)進(jìn)行3d后單酯的生成率不到10%。他們也嘗試了將辛酸換成月桂酸和癸酸，但反應(yīng)產(chǎn)率均不高，沒有實際應(yīng)用價值。本文以蝦青素和琥珀酸酐為底物，嘗試酶法合成蝦青素短鏈酯——蝦青素琥珀酸酯，研究并優(yōu)化了其合成條件。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

蝦青素，純度95.3%，購于Dr.Ehrenstorfer公司。假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase），北京化工大學(xué)贈送。色譜流動相甲醇、乙腈為色譜純，分別購于Dikma technologies公司和Dima technology公司。其他試劑皆為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑北京公司。

1.2 分析測試儀器。

高效液相色譜儀，日本島津公司LC－20A （配SPD－M20A二極管陣列檢測器）。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 （waters UPLC－MS Xevo G2QTOF），美國waters公司。

1.3 蝦青素琥珀酸酯的合成

往25ml具塞錐形瓶中加入5ml DMSO （二甲基亞砜），適量的蝦青素和琥珀酸酐，待兩底物完全溶解后，加入適量脂肪酶搖勻，蓋好瓶塞，外用兩層錫箔紙包好避光置于轉(zhuǎn)速為200r·min－1的恒溫?fù)u床中反應(yīng)，適時取樣分析，檢測蝦青素轉(zhuǎn)化率。文中蝦青素轉(zhuǎn)化率定義為酯化反應(yīng)過程中蝦青素減少量與反應(yīng)前蝦青素總量的百分比，每次實驗重復(fù)3次，取平均值。為了排除蝦青素降解率 （與溫度有關(guān)，5%左右）對轉(zhuǎn)化率的影響，每次實驗均做相應(yīng)空白對照，校正轉(zhuǎn)化率。

1.4 脂肪酶酶活的定義和測定方法

采用橄欖油乳化液水解滴定法測定［13］。酶活定義：脂肪酶在37℃，pH8.0水解橄欖油乳化液每分鐘產(chǎn)生1μmol的脂肪酸所耗用的酶量，即為1個脂肪酶活力單位。

1.5 蝦青素琥珀酸酯的分析方法

蝦青素琥珀酸酯定性分析采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法：色譜質(zhì)譜儀為waters UPLC－MS Xevo G2 QTOF，質(zhì)譜采用電噴霧電離 （ESI）。色譜柱為BEH C18 （100mm×2.1mm，1.7μm），流動相為色譜純甲醇－乙腈 （體積比為9∶1），流速0.4 ml·min－1。

蝦青素轉(zhuǎn)化率的定量檢測采用HPLC法。檢測條件為［14］：色譜柱為Diamonsil C18柱 （250×4.6mm，5μm）。流動相為色譜純甲醇－乙腈 （體積比為9∶1），檢測器為島津20A二極管陣列檢測器，檢測波長475nm，流速1.0ml·min－1，進(jìn)樣量20μl。定量計算為外標(biāo)法。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 蝦青素酯的檢測與定性

蝦青素分子結(jié)構(gòu)兩端各有一個羥基 （—OH），每一個羥基都可以與羧基脫水反應(yīng)生成酯基。圖1是Candidasp.脂肪酶催化蝦青素和琥珀酸酐反應(yīng)樣品典型色譜圖。相對于不加酶空白對照 （色譜圖未列出），樣品中多出現(xiàn)了兩個色譜峰 （峰1，峰2），推測應(yīng)該是酯化產(chǎn)物蝦青素單琥珀酸酯和蝦青素二琥珀酸酯。進(jìn)一步采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測分析，測得色譜峰1，峰2的負(fù)離子質(zhì)譜的最大荷質(zhì)比 （m／z）分別為795.4108，695.3957，而蝦青素二琥珀酸酯和蝦青素單琥珀酸酯負(fù)離子掃描最大質(zhì)荷比理論計算值分別為795.4128和695.3948，誤差均小于5×10－6?？梢娚V峰1是蝦青素二琥珀酸酯，而色譜峰2是蝦青素單琥珀酸酯。實驗結(jié)果表明酶法催化蝦青素琥珀?；缮蓡午晁狨ズ投晁狨?。

圖1 蝦青素酯化反應(yīng)產(chǎn)物HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of succinylation products from astaxanthin

2.2 酶的篩選

分別以足量的固定化酶Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM，Novozym 435和游離假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）為催化劑，在各酶適宜的反應(yīng)溫度下以1mg蝦青素 和100mg琥珀酸酐為底物，5ml二甲基亞砜 （DMSO）為反應(yīng)溶劑，反應(yīng)48h，取樣測定蝦青素轉(zhuǎn)化率，用以評價各脂肪酶催化蝦青素琥珀?；男Ч?（表1）。實驗結(jié)果表明Lipozyme RM IM和Novozym 435脂肪酶催化本反應(yīng)的活力極低，尤其是Lipozyme RM IM催化反應(yīng)48h后檢測不到產(chǎn)物生成。Lipozyme TL IM雖能催化反應(yīng)發(fā)生，但反應(yīng)產(chǎn)率不高。假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）作為催化劑，在所測試脂肪酶中催化效率最高。而且由于假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）是國產(chǎn)粗酶，來源方便、成本低廉，故本文選定Candidasp.脂肪酶為合成蝦青素琥珀酸酯的催化劑進(jìn)行下一步研究。

表1 不同脂肪酶合成蝦青素琥珀酸酯Table 1 Enzymatic synthesis of astaxanthin succinates using different lipases

2.3 脂肪酶反應(yīng)體系

表2 有機溶劑對蝦青素酯化的影響Table 2 Effect of organic solvents on astaxanthin esterification

有機相酶促反應(yīng)中有機介質(zhì)性質(zhì)尤其是其親疏水性是影響催化效果的關(guān)鍵因素。有機溶劑直接影響反應(yīng)體系中底物濃度、傳質(zhì)速率，而且有機溶劑可奪走吸附在酶分子表面的必需水，打斷氫鍵，破壞酶的活性構(gòu)象從而影響酶的活性和穩(wěn)定性［15］。大量研究表明有機溶劑對酶活的影響與溶劑極性密切有關(guān)［16－17］，Laane等［18］認(rèn)為極性參數(shù)logP （有機溶劑在正辛醇／水體系中分配系數(shù)的對數(shù)）可描述溶劑的極性與酶活的關(guān)系，認(rèn)為logP＜2的極性較強的有機溶劑不適合作脂肪酶催化反應(yīng)的介質(zhì)［18－19］。表2為常用代表性有機溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)對蝦青素琥珀酸酯合成的影響。結(jié)果表明logP值顯然不能用來判斷溶劑對Candidasp.酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的影響。在疏水性溶劑正己烷和石油醚反應(yīng)體系中，檢測不到酯的生成，主要原因應(yīng)是琥珀酸酐在這些溶劑中幾乎不能溶解，無法與另一底物蝦青素充分接觸。以N，N－二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜 （DMSO）為反應(yīng)介質(zhì)，轉(zhuǎn)化率較高。這可能與這兩種有機溶劑特殊的物化性質(zhì)有關(guān)，它們既可以溶解親水性物質(zhì)，又可以溶解疏水性物質(zhì)，對蝦青素和琥珀酸酐這兩種底物都有很好的溶解度。但是丙酮同為非質(zhì)子極性溶劑，對這兩種底物的溶解度也很好，而且logP值比DMF，DMSO大，反應(yīng)產(chǎn)率卻不高，其中原因還需進(jìn)一步研究。

2.4 溫度

溫度是影響酶催化作用的主要因素之一。隨著溫度的升高，化學(xué)反應(yīng)速度加快；另一方面，過高的溫度會引起酶的變性失活。而且本反應(yīng)中底物蝦青素化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，過高的反應(yīng)溫度會導(dǎo)致其降解變性，影響反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化率。在不同反應(yīng)溫度下，將1mg的蝦青素和0.1g琥珀酸酐溶于5ml DMSO中，分別加入0.2gCandidasp.脂肪酶反應(yīng)，并設(shè)置不加酶的空白對照以考察溫度對蝦青素降解的影響。反應(yīng)結(jié)果見圖2。在溫度較低 （45℃以下）時，蝦青素的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高而升高。比較45℃和50℃下反應(yīng)進(jìn)程可見：雖然50℃反應(yīng)初速度較快，達(dá)到平衡所需時間短，但其最終轉(zhuǎn)化率和45℃卻沒有明顯差異。究其原因，應(yīng)該是該酶50℃開始明顯失活導(dǎo)致。不加酶空白對照實驗表明 （數(shù)據(jù)未列出），45℃下蝦青素的降解率不到8%，而50℃度時蝦青素的降解率升至15%。綜合轉(zhuǎn)化率和降解率兩者考慮，該酶促反應(yīng)溫度45℃比較適宜。

圖2 反應(yīng)溫度對蝦青素酯化的影響Fig.2 Effect of temperature on astaxanthin esterification（Reaction conditions：1mg astaxanthin，100mg succinic anhydride，5ml DMSO，0.2g Candidasp.lipase）

2.5 摩爾比

由于蝦青素價格昂貴，酯化反應(yīng)中應(yīng)使蝦青素轉(zhuǎn)化相對完全，理論上這可加大琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比來實現(xiàn)。圖3是底物摩爾比對蝦青素的轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果表明摩爾比是此反應(yīng)的關(guān)鍵因素。當(dāng)琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比低于40時，檢測不到酯化產(chǎn)物，說明酯化反應(yīng)基本不能進(jìn)行。底物摩爾比大于40，酯化反應(yīng)才能發(fā)生而且蝦青素的轉(zhuǎn)化率隨摩爾比的升高而升高，兩者摩爾比為800時，轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上，摩爾比升至1200時，蝦青素接近于反應(yīng)完全 （99.1%）。這與文獻(xiàn)報道蝦青素中鏈酯的合成 （底物摩爾比在30以上酯化才能發(fā)生）相一致［8］，可見對于酶催化，蝦青素的羥基活潑性還不夠高，需要在高摩爾比下酯化才能進(jìn)行。底物摩爾比不僅影響轉(zhuǎn)化率，也影響產(chǎn)物組成（表3）。在低摩爾比情況下，主要生成的是單酯，高摩爾比下才有較多的二酯生成。推測該反應(yīng)機理，可能是串聯(lián)反應(yīng)，蝦青素的一個羥基先酯化生成單酯，在高琥珀酸酐濃度下，單酯的另一個羥基再酯化生成二酯，其具體反應(yīng)機理還需進(jìn)一步研究。

表3 底物摩爾比對蝦青素酯化反應(yīng)產(chǎn)物分布的影響Table 3 Effect of substrate molar ratios on esterification products from astaxanthin

2.6 含水量的影響

在有機相酶催化反應(yīng)，微量水的存在對酶維持其活性構(gòu)象至關(guān)重要，絕對無水的體系中酶表現(xiàn)不出活性，而且反應(yīng)體系中的水還影響酯化反應(yīng)的化學(xué)平衡，有時需要采取一些措施去除反應(yīng)中產(chǎn)生的水［20］。催化中水對反應(yīng)的影響不僅與酶有關(guān)，而且與反應(yīng)體系有關(guān)［21］。Sumida等［8］在非極性溶劑正己烷中合成蝦青素中鏈脂肪酸酯研究中發(fā)現(xiàn)，加入適量的水 （0.5%～20%）能極大地提高蝦青素酯的生成率。為了考察蝦青素琥珀酸酯酶促合成中體系含水量對反應(yīng)的影響，先將DMSO脫水處理（加入無水Na2SO4靜置過夜），然后以1mg蝦青素和134mg琥珀酸酐 （即兩者摩爾比為1∶800）為反應(yīng)底物，脫水后DMSO作為酯化反應(yīng)介質(zhì)，分別加入不同的水量，0.2g脂肪酶，45℃條件下反應(yīng)48h，檢測蝦青素的轉(zhuǎn)化率。如圖4所示，當(dāng)反應(yīng)體系中含水量達(dá)到0.5%時蝦青素轉(zhuǎn)化率最高，比文獻(xiàn)報道蝦青素中鏈酯合成所需水量偏低［8］。這主要可能是由于所用酶不同，而且本研究采用的?；噭┦撬狒c文獻(xiàn)中采用的羧酸不一樣。

圖3 底物摩爾比對蝦青素酯化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of substrate molar ratios on astaxanthin esterification

圖4 體系含水量對蝦青素酯化的影響Fig.4 Effect of water content in system on astaxanthin esterification

2.7 反應(yīng)加酶量的影響

以1mg蝦青素和134mg琥珀酸酐為底物（摩爾比為1∶800），以5ml DMSO為反應(yīng)介質(zhì)，加入不同量脂肪酶45℃下反應(yīng)48h后檢測蝦青素的轉(zhuǎn)化率，實驗結(jié)果如圖5所示。脂肪酶含量為0.2g時，蝦青素轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，加大脂肪酶用量，蝦青素轉(zhuǎn)化率不升高反而略有下降。究其原因主要是由于過多的脂肪酶在反應(yīng)體系中分散不好，容易成團，這點在實驗過程中可觀察到。故0.2g脂肪酶為本合成條件下催化劑最佳用量。

圖5 酶量對蝦青素酯化的影響Fig.5 Effect of lipase amount on astaxanthin esterification

3 結(jié) 論

采用假絲酵母脂肪酶 （Candidasp.lipase）成功地對蝦青素琥珀酰化合成了蝦青素琥珀酯。實驗表明酶和反應(yīng)介質(zhì)、底物摩爾比是該酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素：在所考察的幾種酶源中，假絲酵母脂肪酶（Candidasp.lipase）的催化活性最高；DMSO為最合適的反應(yīng)介質(zhì)。底物摩爾比不僅決定了蝦青素的轉(zhuǎn)化率，而且決定了產(chǎn)物的組成，琥珀酸酐和蝦青素摩爾比低于40，酯化反應(yīng)不能發(fā)生，低摩爾比下產(chǎn)物中只有單酯，摩爾比大于150時產(chǎn)物中才出現(xiàn)二酯。同化學(xué)法相比，生物酶法合成維生素E酯具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品色澤好等優(yōu)點，符合綠色化學(xué)發(fā)展方向，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。本文反應(yīng)產(chǎn)物為蝦青素單酯和二酯的混合物，影響這兩種產(chǎn)物的相對含量的因素，以及這兩種酯的穩(wěn)定性及生理功能還需要進(jìn)一步研究。

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